總是會看到人家提取的細(xì)胞，拍的漂漂亮亮的圖片，在面前晃，然而，輪到自己，發(fā)現(xiàn)并不是準(zhǔn)備細(xì)胞—固定細(xì)胞—細(xì)胞通透—封閉—上一抗—上二抗-染核-鏡檢這么簡單，后來發(fā)現(xiàn)，不要50個(gè)字都可以形容出來的實(shí)驗(yàn)步鄹，卻這么難。。。

五點(diǎn)建議讓你避開免疫熒光的坑，美美的show一把自己的成果，也對的起因?yàn)閷?shí)驗(yàn)掉的大把的頭發(fā)了。

1.考慮抗體的建議稀釋度，以實(shí)現(xiàn)高的信背比。若抗體濃度過低，則熒光信號較弱，可能難以與背景區(qū)分開，但抗體濃度過高，則會導(dǎo)致較高的背景染色?！?/span>

2.利用生理溶液來洗滌，可去除未結(jié)合的熒光試劑，或那些只是粘在目標(biāo)上而非特異性結(jié)合的熒光試劑，從而提高信背比。

3.熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護(hù)其光譜完整性。

4.在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮每種熒光基團(tuán)的獨(dú)特性質(zhì)，如最大吸收波長和最大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素一定要讓您的試劑和使用的儀器匹配；

5.一定要有對照，原代細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，一般建議使用不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞或組織作為陰性對照。而熒光Western blot或ELISA技術(shù)中，含有目標(biāo)抗原的蛋白或肽段適合作為陽性對照。

提取的原代細(xì)胞一般都采用免疫熒光檢測細(xì)胞幾個(gè)主要的marker，以確定細(xì)胞的真實(shí)性，如Cell Systems的主動脈原代細(xì)胞，檢測CD 62E (E-Selectin)，VWF / Factor VIII，Di-I-Ac-LDL三個(gè)主要的marker，還進(jìn)行了出庫的標(biāo)準(zhǔn)測試，無HIV, BPV 和支原體檢測等。

一些常見的坑：

一．信號弱或無信號，染色細(xì)胞過少可以考慮以下幾點(diǎn)：

1.目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中沒有表達(dá)

解決辦法：制備細(xì)胞裂解液，用 Western Blo tting 驗(yàn)證目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中是否表達(dá)

2.表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞過少

解決辦法：標(biāo)本中使用更多的細(xì)胞，試用其他瞬 時(shí)轉(zhuǎn)染方法，或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

3.細(xì)胞通透性差

增加通透劑作用的時(shí)間或者濃度，或 改用其它的通透劑

4.染色前的固定步驟破壞了抗原表位

改用其他固定方法

5.抗體問題

抗體不適合，抗體選擇錯(cuò)誤或者抗體稀釋不標(biāo)準(zhǔn)也會導(dǎo)致無信號，建議按標(biāo)準(zhǔn)稀釋，同一樣品按最佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定最佳的一抗稀釋比例，

二.視野中細(xì)胞不細(xì)胞之間存在散在的發(fā)光點(diǎn)：

答：：1，拍照時(shí) PBS 量過少引起的非特異性；

PBS 未過濾，未溶解的殘?jiān)じ蕉鴮?dǎo)致

三．鏡下觀察只有 DAPI 的藍(lán)光，目的熒光幾乎沒有戒者很弱？

出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗 濃度；共聚焦的激發(fā)熒光強(qiáng)度丌夠大；二抗孵育時(shí)是否是對應(yīng)的種屬。

四．細(xì)胞核周圍總是存在有一些藍(lán)色的小點(diǎn)點(diǎn)？

此種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥 2 周后再檢測，戒者通 過提高共聚焦機(jī)器背景值來覆蓋支原體熒光。