免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。

一、洗載玻片 

二、二、用石蠟包埋組織 

三、將包埋好的組織切片，一般為5um，切片之后置于40 ℃溫水中

四、撈組織

五、脫蠟，依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精每個(gè)試劑中放10min，若天氣冷可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間

六、抗原修復(fù)常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱分為高壓加熱修復(fù)、微波修復(fù)和胰管修復(fù)三種。高壓加熱修復(fù)操作簡(jiǎn)單，效果優(yōu)于其它修復(fù)方法。

抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)：

（1）組織不能干。

（2）選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。

（3）該方法主要用于10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

（4）抗原修復(fù)后至DAB顯色的過(guò)程中，均需用PBS緩沖液

七、血清封閉為了防止一抗與組織的非特異性結(jié)合，可用牛血清或山羊血清阻斷這些位點(diǎn)。閉鎖血清通常來(lái)自同一二抗動(dòng)物，在室溫下閉鎖時(shí)間為10-30分鐘。 

八、加一抗

九、加二抗

十、加SABC 

十一、加顯色劑（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB   B：H2O2   C：磷酸緩沖液 

十二、復(fù)染

將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。 

十三、脫水

十四、封片

操作需要注意的事項(xiàng)：

1.    蘇木素復(fù)染時(shí)間需要摸索，尤其陽(yáng)性染色也在細(xì)胞核上。 

2.    DAB 顯色時(shí)間需要達(dá)到最優(yōu)化，鏡下觀察達(dá)到陽(yáng)性染色明顯但背景不太深。 

3.    抗體孵育時(shí)間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育最好在 4 度過(guò)夜。 

4.    切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時(shí)要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但

又防止干片；用組化筆畫(huà)圈時(shí)盡量畫(huà)大一點(diǎn)，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。