MTT實(shí)驗(yàn)操作

日常中的MTT實(shí)驗(yàn)一般都是藥敏實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的成功一般也和細(xì)胞鋪板的均勻性，一致性及細(xì)胞活性惺惺相關(guān)。

MTT 溶液的配制方法：

1. MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
2. 配制MTT時(shí)用PBS（pH=7.4）溶解。

PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g調(diào)pH7.4，定容1L。 

藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：

貼壁細(xì)胞：
1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度1000- 10000 /孔，每次加入細(xì)胞的槍頭貼著96孔的四周，旋轉(zhuǎn)緩慢加入，加入細(xì)胞后可前后左右水平搖晃幾下，以讓細(xì)胞鋪板更佳。

2. 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上細(xì)胞貼壁后即可加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，一行12個(gè)孔，兩個(gè)PBS填充孔，兩個(gè)對(duì)照孔，兩個(gè)空白孔，6個(gè)復(fù)孔

3. 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6. 每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

7. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

懸浮細(xì)胞：

1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml（細(xì)胞濃度的問題見后面的注意事項(xiàng)），按次序?qū)?/span>①補(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲(chǔ)存液100mg/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100ml 1640）

2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）

4. 離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。

 5. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：細(xì)胞存活率%=(加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）x100

春節(jié)就要到了 ，祝愿大家實(shí)驗(yàn)越來越順，項(xiàng)目基金越來越多！