大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞價格3500，技術(shù)小骨瞟了一眼，說，買個90-110克的健康雄性大鼠才幾十塊錢，國產(chǎn)抗體也那么便宜，為啥不自己提？

說動手就動手，采購也不是忽悠的料，第二天，大鼠到家，小骨開始施展主動脈平滑肌細(xì)胞分離花式手法。

分離培養(yǎng)VSMC的方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法。

前者以器械機(jī)械剝離外膜、刮除內(nèi)膜、將血管剪成1mm3的小塊經(jīng)細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。該方法對操作技巧要求高，剝離外膜時易有殘留，刮除內(nèi)膜時用力過小會有內(nèi)皮細(xì)胞殘留、用力過度則易刮傷中膜層。因此，初學(xué)者采用此方法進(jìn)行VSMC分離時，經(jīng)常有組織塊漂浮、細(xì)胞培養(yǎng)時間過長的問題。

酶消化法則是采用蛋白酶對剔除干凈周圍組織的血管進(jìn)行直接消化來分離VSMC。采用膠原酶、胰酶單一消化或者二酶復(fù)合消化進(jìn)行VSMC分離，但是膠原酶消化時間一般需要6?12小時不等，而胰酶對VSMC有較強(qiáng)的損害，消化時間不易掌握，容易消化不均勻?qū)е聦ζ交〖?xì)胞損傷較大，不易得到活性好、數(shù)量多的平滑肌細(xì)胞。

所以目前一般采用的是聯(lián)合酶消化法和組織塊貼壁法來提取平滑肌細(xì)胞

1. 取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主動脈；取出后置于1-4 °C的容器中。

2.用2ml的注射器取PBS或者高壓滅菌的生理鹽水。反復(fù)沖洗胸主動脈，去掉其表面粘附的凝血等組織塊并剔凈血管的周圍組織

3.然后放入酶消化液中、在37°C的氣浴恒溫振蕩器里消化45分鐘，隨胸主動脈的大小和酶液活性變化略加變動。當(dāng)消化過程中觀察到血管變透明、周圍組織成絮狀可終止消化隨后剝離血管外膜層、刮除內(nèi)膜層和剝離中膜層；

4.含Ca2+、Mg2+的HBSS漂洗分離的中膜層，置于干凈的培養(yǎng)皿進(jìn)行快速剪碎(1-2mm3)，然后轉(zhuǎn)入放有復(fù)合酶液的6孔板內(nèi)進(jìn)行二次消化，消化在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行，時間為I小時左右，每20分鐘取出輕微晃動。消化50分鐘后一般可觀察到有大量細(xì)胞在組織塊表面呈葡萄狀暴露并開始游離出來這時候加平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，備注：終止消化的培養(yǎng)基需提高血清含量到10%.

5.用1ml的注射器抽打組織消化液直至細(xì)胞基本從組織殘片中脫離，再用細(xì)胞篩過濾(細(xì)胞篩孔徑為40μπι)獲得懸液;取濾網(wǎng)上的組織，重復(fù)抽打和過濾，將多次過濾后的細(xì)胞懸液一起轉(zhuǎn)移到15ml的離心管里，1000轉(zhuǎn)/分、離心5分鐘收集細(xì)胞；

6.取含10%FBS的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，種入6孔板進(jìn)行培養(yǎng)。

7.新鮮分離的P0代VSMC懸浮于平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，于孵箱里靜止培養(yǎng)2天，37 °C，5 %CO2。

8.48小時后觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已貼壁并開始鋪展更換新的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天左右可傳代 ，傳代后血清降至2%的正常血清。