1. 用冰冷的PBS緩沖液洗滌兩次在組織培養(yǎng)盤或瓶內(nèi)貼壁的細(xì)胞，之后排掉PBS。并且也用PBS洗滌非貼壁細(xì)胞，接著在桌面型離心機(jī)中，用轉(zhuǎn)速800 - 1000轉(zhuǎn)/分鐘去離心5分鐘，以沉淀細(xì)胞。

2. 添加冰冷的RIPA改良緩沖液至細(xì)胞（加1毫升至每10 ⁷個細(xì)胞/100 mm組織培養(yǎng)盤/150平方厘米組織培養(yǎng)盤瓶，加0.5毫升至每5 × 106個細(xì)胞/60mm組織培養(yǎng)/75平方厘米組織培養(yǎng)瓶）。

3. 使用已在冰的蒸餾水中冷卻之一個橡皮淀帚或塑料細(xì)胞刮棒，于組織培養(yǎng)盤或瓶內(nèi)，刮下貼壁的細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)移該細(xì)胞懸液到離心管中。

4. 將離心管放置在搖床恒溫箱或定軌振蕩器上，并于4攝氏度輕輕搖動該懸浮液15分鐘，以裂解細(xì)胞。

5. 之后，使用已經(jīng)預(yù)冷的離心機(jī)，以14000 × g離心細(xì)胞裂解物15分鐘。完成后，立即將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，并棄去舊離心管的沉淀物。

6. 當(dāng)制備蛋白A或G瓊脂糖（或瓊脂糖凝膠）時，用PBS清洗瓊脂糖珠粒兩次，并維持50％的漿料在PBS中。于操作瓊脂糖珠粒過程，我們建議以切斷尖端的吸管去操縱，以避免珠粒的分裂破壞。

7. 于每1 ml細(xì)胞裂解物中加入100微升蛋白A或蛋白G的瓊脂糖/瓊脂糖珠粒漿（50％），以預(yù)澄清該細(xì)胞裂解物；為此，放置在搖床恒溫箱或定軌振蕩器上，在4攝氏度下培育10分鐘。預(yù)澄清的細(xì)胞裂解物，將可以減少在稍后測定實(shí)驗(yàn)使用時，因細(xì)胞蛋白質(zhì)與瓊脂糖/瓊脂糖凝膠的相互作用，所產(chǎn)生的非特異性結(jié)合。

8. 以在4攝氏度離心14000 x g 10分鐘去移除蛋白A或蛋白G珠粒，并將上清液轉(zhuǎn)移到另一個新的離心管中。

9. 要確定細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度，可以如通過Bradford進(jìn)行測定。但注意，測定蛋白質(zhì)濃度之前，該細(xì)胞裂解物至少要1:10倍稀釋，因?yàn)樵诹呀饩彌_液中的洗滌劑，會受到考馬斯基試劑的干擾。

10. 用PBS稀釋細(xì)胞裂解物的總細(xì)胞蛋白量至約1微克/微升，以減少在緩沖液中洗滌劑的濃度﹔然而，若是一個低蛋白貭量水平的細(xì)胞模型，可能必要有更濃縮的細(xì)胞裂解物（即10微克/微升）以免疫沉淀該蛋白貭。此時，添加推薦量的免疫沉淀抗體（參見數(shù)據(jù)表的詳細(xì)信息）到500 ul的細(xì)胞裂解液（即500微克）。但若要得到免疫沉淀任何目的蛋白質(zhì)應(yīng)使用抗體的最佳量，那必要根據(jù)對每個細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)去確定。

11. 在室溫中以搖床恒溫箱或定軌振蕩器，輕輕搖動細(xì)胞裂解物 - 抗體混合物2小時，或在4攝氏度搖動過夜。以室溫?fù)u動培育2小時，是被推薦用于免疫沉淀有活性的磷酸激酶或磷酸水解酶的培育的時間。

12. 通過加入100 ul的蛋白A或G瓊脂糖/瓊脂糖珠粒漿液（等同50 ul緊壓珠粒），和在搖床恒溫箱或定軌振蕩器室溫中輕搖1小時，或在4攝氏度輕搖過夜，將可以捕獲蛋白質(zhì) - 抗體免疫復(fù)合物。在許多情況下，如果額外添加2 ul的橋連抗體（例如：兔抗小鼠IgG），我們能夠增強(qiáng)捕獲該免疫復(fù)合物的能力。這方法對于一些結(jié)合蛋白A不良的抗體，譬如小鼠IgG1或在雞的抗體尤其重要。

13. 然后，通過脈沖離心（即在14,000rpm下離心5秒）去收集瓊脂糖/瓊脂糖珠粒。棄去上清液，并用800 ul冰冷的改良RIPA緩沖液沖洗珠粒3次。偶爾，用此改良RIPA緩沖液沖洗瓊脂糖/瓊脂糖珠粒，會剝離掉結(jié)合其上的蛋白質(zhì) - 抗體免疫復(fù)合物。在這情況下，推薦用溫和的PBS緩沖液去洗滌。

14. 最后懸浮瓊脂糖/瓊脂糖珠粒在60 ul 濃度2倍的樣品緩沖液中，并輕輕混勻；這懸浮液將足夠使用于三個電泳的泳道。將瓊脂糖/瓊脂糖珠粒煮沸5分鐘，以從珠粒上解離其蛋白質(zhì) - 抗體的免疫復(fù)合物。再以離心收集珠粒，而用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測上清液?；蛘邔⑸锨逡恨D(zhuǎn)移到一個新的離心管中，并在攝氏-20度冷凍貯存，供以后使用。如是冷凍的上清液應(yīng)直接再煮沸5分鐘，才作凝膠電泳。

二：需要注意的節(jié)點(diǎn):

1.如果使用預(yù)先已經(jīng)制備的細(xì)胞裂解物，請由第5步驟開始。

2.大多數(shù)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)需在 4℃下進(jìn)行，同時依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶崆皩⒌鞍酌敢种苿┖突?/span>磷酸酶抑制劑添加到裂解液中

3.IP/Co-IP 實(shí)驗(yàn)的成功與否與蛋白樣品質(zhì)量（抗原質(zhì)量）息息相關(guān)，選擇合適的蛋白制備方案，提高蛋白樣品質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)的成功必要條件。