熒光素酶報告基因系統(tǒng)，是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統(tǒng)， 測定酶與底物反應(yīng)過程中釋放的生物熒光反映酶生物活性。螢火蟲熒光素酶基因作為報告基因，用于指示不同處理條件下基因的表達(dá)情況。螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）大小為 61 KDa，單亞基蛋白，能夠催化熒光素（luciferin）氧化，生成氧化熒光素 oxyluciferin； 螢火蟲螢光素酶催化 luciferin 發(fā)光的最強發(fā)光波長為 560 nm。通常將目的基因的 5′UTR 或者啟動子克隆至 Firefly Luciferase 的上游，或者 3′UTR 或預(yù)期 RNAi 靶向序列克隆至 Firefly Luciferase 的下游，通過檢測螢火蟲熒光素酶與底 物的反應(yīng)活性來檢測啟動子或者調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Renilla Luciferase 作為內(nèi)參 來消除細(xì)胞數(shù)量或者轉(zhuǎn)染效率等實驗組間差異。

1.細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度：一般來說，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時進行轉(zhuǎn)染可以取得較高的 轉(zhuǎn)染效率。但不同細(xì)胞的最適轉(zhuǎn)染密度都不盡相同，因此建議在初次轉(zhuǎn)染某種細(xì)胞時，可以通過預(yù)實驗先確認(rèn)該細(xì)胞最佳的轉(zhuǎn)染密度。

2. 轉(zhuǎn)染 根據(jù)效率評價，擴大體系進行相對應(yīng)的轉(zhuǎn)染 例：12 孔板，體系 500 μL

3. 裂解細(xì)胞

待轉(zhuǎn)染至相應(yīng)的時間后，棄培養(yǎng)液，PBS洗一次，將細(xì)胞裂解液完全覆蓋細(xì)胞充分混 勻，按以下方式加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，約 30 min~1 h

供參考： 

4. 熒光檢測

1）取 100 μL 細(xì)胞裂解液，加至酶標(biāo)板中。按照實驗需要，可設(shè)置 3 孔-5 孔重復(fù)；

2）加入 5 μL 螢火蟲熒光素酶反應(yīng)液，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力，檢測 盡量在 30 min 內(nèi)完成。

3）分析數(shù)據(jù)。 注：因酶在不同細(xì)胞表達(dá)量有所不同，故底物量依不同細(xì)胞有所差異，優(yōu)化區(qū)間可參考 5-20 μL。