克隆形成試驗(yàn)是一種有用的工具，用于測試給定的癌癥治療是否可以降低腫瘤細(xì)胞的克隆形成存活率。菌落被定義為至少由50個細(xì)胞組成的集群，通常只能在顯微鏡下確定?？寺⌒纬稍囼?yàn)是確定電離輻射治療后細(xì)胞繁殖死亡的首選方法，但也可用于確定其他細(xì)胞毒性藥物的有效性。以下方案已從已發(fā)布的版本中進(jìn)行了修改（Franken等人，2006年）。

材料和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基

磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）(啟達(dá)生物，貨號：SD0029)

胎牛血清(啟達(dá)生物，貨號：SD0200)

胰蛋白酶/EDTA

結(jié)晶紫

甲醇

冰醋酸

菌落固定溶液

結(jié)晶紫溶液

設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)皿或六孔板

血細(xì)胞儀

立體顯微鏡

血細(xì)胞儀

恒溫箱

操作步驟

1.根據(jù)參考文獻(xiàn)選擇自己所需要培養(yǎng)的細(xì)胞。

2.取出培養(yǎng)基，然后用10ml PBS沖洗細(xì)胞。

3.向細(xì)胞中加入4ml 0.25%胰蛋白酶，并在37°C下孵育1-5分鐘，直到細(xì)胞呈圓形。

4.加入10ml含有10%FBS的培養(yǎng)基，通過移液分離細(xì)胞。

5.使用血細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

注意：獲得相對準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)是至關(guān)重要的。

6.準(zhǔn)備所需的接種濃度，然后將細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿或6孔板中。

處理前電鍍：

1. 收獲細(xì)胞，并在6孔板上的每個培養(yǎng)皿或每個孔上培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，至少一式兩份。用于接種的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)根據(jù)處理的侵略性來確定。在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)小時，并使其附著在培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿上。

2. 必要時用化學(xué)物質(zhì)、輻射（如2-10Gy）或兩者的組合處理細(xì)胞。

3. 將細(xì)胞在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3周，直到對照板中的細(xì)胞形成大小基本良好的集落（每個集落50個細(xì)胞是評分的最低值）。

處理后的鍍層：

1. 處理后收獲細(xì)胞。可以電鍍50個或最多50 x 104個細(xì)胞。如果治療效果不清楚，用不同數(shù)量的細(xì)胞制備系列稀釋液。對于放射治療，細(xì)胞可以在治療后立即接種或稍后重新接種。在重新接種之前，最好將細(xì)胞放在冰上。

2. 將細(xì)胞在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3周，直到對照板中的細(xì)胞形成大小基本良好的菌落（每個菌落50個細(xì)胞是評分的最低值）。

固定和染色：

1.取出培養(yǎng)基，然后用10ml PBS沖洗細(xì)胞。

2.取出PBS，加入2-3毫升固定溶液，將培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板在室溫（RT）下放置5分鐘。

3.取出固定溶液。

4.加入0.5%結(jié)晶紫溶液，在室溫下孵育2小時。

5.加入10ml含有10%FBS的培養(yǎng)基，通過移液分離細(xì)胞。

6.小心地去除結(jié)晶紫，將盤子浸入自來水中沖洗掉結(jié)晶紫。

7.在室溫下，將碗碟/盤子放在桌布上風(fēng)干幾天。

數(shù)據(jù)分析：

1.用立體顯微鏡計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

2.計(jì)算電鍍效率（PE）和存活率（SF）。

PE=形成的菌落數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)x 100%

SF=處理后形成的菌落數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)x PE

菌落固定溶液配方

乙酸/甲醇1:7（體積/體積）

結(jié)晶紫0.5%溶液

參考文獻(xiàn)：Yang, X. (2012). Clonogenic Assay. Bio-protocol 2(10): e187. DOI: 10.21769/BioProtoc.187.