遇上實驗需要的角膜緣間充質(zhì)基質(zhì)該怎么提取，以下是我們的提取步驟,點個關(guān)注，提取原代不迷路:

準備試劑：

12孔板、微量移液管尖端、60mm細胞培養(yǎng)皿、100 mm細胞培養(yǎng)皿

注射器過濾器0.2μm、10號一次性手術(shù)刀刀片、15 mL錐形管

T75培養(yǎng)瓶最好選康寧的，可逆細胞過濾器、細胞過濾器20μm、FACS管（5 mL聚苯乙烯圓底管，Falcon，目錄號：352058）、膠原酶A、Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水（啟達貨號：SD0030)

0.25%胰蛋白酶-EDTA、MSCM干細胞培養(yǎng)基（低血清）、FGM成纖維培養(yǎng)基、70%乙醇、0.5 M EDTA、CD90、CD44、小鼠IgG2a，k同種型APC、.細胞角蛋白AE1/AE3、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）.

細胞分離步驟：

1.將角膜緣段置于含有5 mL膠原酶a（2 mg/mL）的60 mm培養(yǎng)皿中，并用手術(shù)刀片切割

將角膜緣部分切成更小的部分（2-3塊）。在37°C和5%二氧化碳條件下培養(yǎng)以膠原酶過夜消化并獲得角膜緣細胞簇。

2.培養(yǎng)后，使用1mL移液管上下吹打，在培養(yǎng)皿內(nèi)吹打成細胞懸液并在顯微鏡下觀察細胞簇和單細胞的存在，這個細胞簇應(yīng)該由角膜緣上皮細胞、基質(zhì)細胞和黑素細胞小眾細胞組成（如圖1所示）。

注：如果培養(yǎng)和研磨過夜后角膜緣部分不完全消化，則在37°C的同一溶液中用5%CO2再培養(yǎng)2小時，以實現(xiàn)完全消化。相反，組織的過度消化（超過20小時）可能會影響細胞活力和細胞質(zhì)量。

A.將角膜鞏膜緣（左）切成扇形，在前后將每個扇形切除1mm邊緣區(qū)域（右）。來自Polisetti等人（2019）文獻。

B. 不同尺寸角膜緣段在膠原酶中孵育過夜后形成的角膜緣簇和單細胞溶液不同（放大x40倍）。

C. 過濾從單個細胞分離的邊緣簇。

D.單細胞需用胰蛋白酶-EDTA消化角膜緣簇并形成角膜緣細胞懸浮液

3.使用孔徑為20μm的細胞過濾器將角膜緣細胞簇從單個細胞中分離出來，未通過細胞過濾器的細胞和待保留的簇用DPBS清洗過濾器兩次，以移除任何剩余的單個細胞。反轉(zhuǎn)濾網(wǎng)，將其放在一個60毫米的盤子上。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA（5 mL）將簇沖洗到培養(yǎng)皿中，并在37°C下孵育10-15分鐘，以將簇解離成單個細胞。

注：可以使用37μm可逆式細胞過濾器代替20μm細胞過濾器。單細胞懸浮液離心后獲得角膜緣成纖維細胞，使用FGM （啟達生物：P6001)（圖2)直接培養(yǎng)即可，得到角膜成纖維細胞就是這么簡單。

再繼續(xù)角膜基質(zhì)細胞提?。?/span>

4.孵育完成后，用1mL移液管上下吹打，研制細胞懸浮液。直到看到

顯微鏡下的細胞懸浮液停止吹打。添加5 mL含有10%FBS的預熱DMEM（37°C水?。﹣硪种埔鹊鞍酌赶?。將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管，以200×g離心5分鐘。

注：如果在孵育和研磨15分鐘后簇不完全解離，則在在37°C和5%CO2的膠原酶中再攪拌5分鐘，以實現(xiàn)完全解離。相反，簇的長時間消化可能會對細胞活力和細胞質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。

5. 離心后，通過使用P200移液管加200μL FACS緩沖液（見配方3）進行熒光激活細胞分選（FACS）

1.將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到FACS管（100μL/管）中，并加入小鼠APC綴合的抗人將CD90抗體（5μL/106個細胞）連接到一根試管，并在4°C下將IgG2a同種型APC連接到另一根試管。輕輕地使樣品渦旋，并在冰上孵育45分鐘，每隔15分鐘輕敲一次。

注：如果細胞數(shù)較高，即超過10^6個細胞，則按照細胞數(shù)量調(diào)整抗體的體積和濃度

2.培養(yǎng)后，向每個FACS管中加入1mL FACS緩沖液，并將細胞以400×g離心5min.重復洗滌兩次。

3.洗滌后，加入500μL含有DAPI的FACS緩沖液（1:5000），以排除死細胞，然后繼續(xù)

使用FACS Aria II分類器進行流式分揀（參考Polisetti等人，2022）

6. 角膜緣間充質(zhì)基質(zhì)細胞的培養(yǎng)

1.將分選的CD90+LMSC播種到12孔板的孔上。

注：每個角膜緣的CD90+細胞數(shù)量（150–900）因樣本而異。CD90-群體主要含有LEPC，可以使用細胞類型特異性培養(yǎng)基來富集LEPC（參考Polisetti等人，2020）。

2.在37°C和5%CO2的MSCM（啟達貨號：P2001)(圖三）完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)LMSC。每2天換液一次。

3.通過相差顯微鏡觀察LMSC的形態(tài)。LMSC表現(xiàn)為紡錘形，具有突出核仁的細長細胞（圖4）。

7.角膜緣間充質(zhì)基質(zhì)細胞的傳代

1當細胞生長到80-85%以上的匯合度開始準備傳代；

2.使用DPBS洗滌細胞，并加入1mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%；在水浴中在37°C下預熱）。

常溫條件下培養(yǎng)1-3分鐘。

3.顯微鏡下觀察細胞變得橢圓透亮后，輕拍細胞瓶壁，加入2mL MSCM完全培養(yǎng)基以抑制胰蛋白酶的作用，并充分混合。

4.將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL試管中，并以200×g離心5分鐘。重新懸浮細胞顆粒在MSCM（啟達貨號：P2001)完全培養(yǎng)基中，并使用血細胞儀計數(shù)總細胞數(shù)。

5.將細胞用于實驗或用于傳代培養(yǎng)及凍存。

注：過度融合（超過85%）和延長胰蛋白酶消化（超過5分鐘）會產(chǎn)生不利影響，在細胞培養(yǎng)過程中影響細胞活力和細胞質(zhì)量。細胞傳代率始終為80%至85%匯合度同時應(yīng)避免在胰蛋白酶中長時間孵育。