走上人跡罕至的道路，產(chǎn)生一個敲除細胞系而不是敲除細胞？我們在這篇文章中為您介紹了利用同源定向修復途徑、設計最佳供體DNA以及避免此類基因組編輯中常見事故的技巧和竅門。

敲入突變和基因編輯

靶向基因組編輯事件分為兩大類：細胞敲除和動物敲除。敲除的目的是通過產(chǎn)生移碼突變來破壞DNA翻譯。大多數(shù)細胞修復事件都會產(chǎn)生這些類型的突變，使其成為一項“簡單”的編輯工作。然而，對于敲門磚來說，情況并非如此。敲入突變通常需要在精確的基因組位置結合精確的DNA序列，幾乎沒有錯誤的余地。毫不奇怪，這些編輯比淘汰對手需要更多的計劃和技巧。

要開始一個敲門實驗，首先要問的問題是從哪里敲除，所以需要確定你想在基因組中引入你的敲門磚的位置。然后再選擇使用哪種Cas酶，并設計一個gRNA到你想引入編輯的地方。最后，你必須知道引入什么序列，這是通過設計和使用供體DNA分子來完成的。你的供體分子需要與新序列兩側的靶基因座具有同源性。這種同源性將引導細胞使用供體DNA作為修復的模板，這樣才會讓你的序列的結合，最后敲除成功！那么，捐贈者是如何被用作修復的模板的呢？請看以下分解。

同源性定向修復與基因組工程

制造敲除細胞系的最簡單方法是利用細胞已經(jīng)具有的內(nèi)置修復途徑來修復DNA雙鏈斷裂——（HR）。

HR是哺乳動物細胞中占主導地位的同源定向修復（HDR）途徑，但通常是一種不太常見的DNA修復機制。平均而言，它只占DNA修復不到10%，不同細胞類型的修復率各不相同。差異可能是由細胞周期速率引起的；快速生長的細胞將比緩慢的細胞具有更高的HR頻率。重要的是要知道HR經(jīng)常在癌癥細胞中發(fā)生突變，特別是在實驗室常用的乳腺和卵巢細胞系中。建議您在嘗試HDR敲除之前檢查細胞系中HR相關的突變。

圖1：通過同源重組修復DNA雙鏈斷裂的早期步驟。

設計HDR

HDR途徑的基礎依賴于模板分子的修復，模板分子通常是內(nèi)源性可用的姐妹染色單體，盡管也可以使用外源DNA。以下是為成功的HDR活動設計供體DNA的一些考慮因素。

CRISPR切割位置

將CRISPR切割部位盡可能靠近敲入位置。HDR依賴于在斷裂部位切除形成ssDNA，并利用ssDNA的末端找到修復模板。當插入物在斷裂的10bps以內(nèi)時，觀察到最高的HDR效率，使切割基本上作為模板DNA的一部分。

同源序列和樣本類型

為了確保你的供體分子被用作模板，你需要在敲入位點的右邊和/或左邊加入同源序列。該序列的長度和組成（單股與雙股）都取決于載體的大小。同源序列至40bps的單鏈寡核苷酸供體（ssODN）可以有效地敲入幾百bps的序列。然而，如果你有一個更大的敲除（200 bp–2 kb），由于寡核苷酸的合成限制，將需要使用dsDNA供體。這些載體傳統(tǒng)上在500bp至1kb范圍內(nèi)具有較大的同源序列，然而，最近也有使用了較短的同源區(qū)并取得了一些成功（Yu等人，Nat Chem Biol）。

突變PAM或sgRNA序列

Cas9可能在靶位點經(jīng)歷多輪切割，直到PAM位點或引導物識別序列的一部分通過突變被破壞。通過在供體DNA的PAM或引導識別序列中引入突變，可以保證HDR后不會再靶向。如果你的Cas9切入了一個基因的編碼區(qū)，請確保你引入的PAM編輯是一個沉默的突變，這樣你就不會意外地改變你感興趣的蛋白質(zhì)。

圖2：停止PAM的再切割并引導供體DNA中RNA破壞突變

將HDR提升到其他編輯之上

HDR并不是DNA修復最常見的編輯途徑。在HDR編輯時要傾斜刻度，您可以嘗試以下一個或多個不同的編輯位置。

其他修復機制

除了HR之外，哺乳動物細胞還有兩種主要的修復機制——非同源末端連接（NHEJ）和替代末端連接（alt-EJ）。對這兩種途徑的重要成分的抑制劑已被證明對增加HR編輯成功是有效的（Yang等人，Int J Mol Sci）。在引入Cas9之前和之后，將這些抑制劑添加到培養(yǎng)基中會增加HDR，只需確保在一兩天內(nèi)去除抑制劑，以免影響細胞的生存能力。

富集S期細胞

HR主要作用于細胞周期的S期和G2期，此時姐妹染色單體可能作為修復模板存在。要最大限度地提高HDR釋放，請確保細胞在細胞周期階段中積極循環(huán)。如果細胞過度融合或培養(yǎng)基中沒有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，它們就不會進行DNA復制，所以一定要注意這些細胞！更進一步，你可以抑制負責S期過渡的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，使細胞在HDR促進的周期中停留更長時間。如果細胞停留時間過長，這種方法可能會對生存能力產(chǎn)生一些負面影響。長時間的細胞周期停滯可以在短短10小時內(nèi)導致細胞凋亡。

使用快速的Cas剪輯

如果晉升人力資源就像換掉你的Cas9一樣簡單呢？可以！Cas12a是Cas家族成員，在切割時會產(chǎn)生粘性末端。Cas12a可能通過在斷裂部位產(chǎn)生ssDNA懸突來促進HDR，這是早期的HR步驟（Moreno-Mateos等人，Nat-Com）。

另一種用于啟動HR的Cas斷裂的方法是將HR蛋白融合到核酸酶上。與Cas9融合的早期HR因子已被證明可以通過在其他因子加載到斷裂上之前中斷進行HR來增加HDR頻率，從而可能使修復沿著不同的途徑來進行（Charpentier等人，Nat-Com）。

圖3:HDR切入與NHEJ介導的小插入和缺失型編輯競爭。

References

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