THP-1細(xì)胞，這是一種可以分化為巨噬細(xì)胞的人類白血病單核細(xì)胞系。這允許在無直接細(xì)胞接觸交互作用的情況下，研究巨噬細(xì)胞分泌體對共培養(yǎng)癌癥細(xì)胞的影響（例如，對生長、藥物反應(yīng)或基因表達(dá)的影響），體外THP-1單核細(xì)胞分化為極化巨噬細(xì)胞用于研究M1和M2型巨噬細(xì)胞群體對其他細(xì)胞的影響，M1型巨噬細(xì)胞通常被認(rèn)為是抑制腫瘤的，而M2型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為具有組織修復(fù)和腫瘤生長促進(jìn)活性，因此thp-1擁有的兩極分化是很多實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，以下是THP-1分化實(shí)驗(yàn)步驟，點(diǎn)贊收藏，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不迷路。

準(zhǔn)備材料：
Transwell inserts 0.4 μM ，THP細(xì)胞（啟達(dá)生物貨號：CD0122)，1640含有10%FBS的正常培養(yǎng)基（啟達(dá)生物 ，貨號：MD0201），IL4、IL13、IFN-γ儲備溶液、PMA（見實(shí)驗(yàn)步驟）LPS（見實(shí)驗(yàn)步驟）

實(shí)驗(yàn)試劑制備：

IL4原液、IL13原液、IFN-γ儲備溶液配制：在PBS含有0.05%BSA中制成100ug/ml，分裝并于-80°保存；使用時(shí)：在無菌PBS中稀釋至40μg/μl的濃度，然后等分并在-20°C下儲存

脂多糖:在無菌PBS中稀釋至40μg/μl的濃度，然后等分并在-20°C下儲存

實(shí)驗(yàn)步驟：

Day 1:

1. THP-1細(xì)胞在RPMI/FCS培養(yǎng)基中懸浮生長，一旦接種到transwell插入物中就進(jìn)行激活。使用手套在插入物的無菌邊緣處理插入物。

2.使用血細(xì)胞儀對THP-1細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，制成濃度為1×105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。

3.然后通過每6個孔加入2ml RPMI/FCS培養(yǎng)基來制備一個6孔板。然后將transwell插入物放入含有2ml培養(yǎng)基的6孔中。

4.將2ml THP-1細(xì)胞懸浮液加入到插入物中（2x105個細(xì)胞/插入物）。

5. THP-1細(xì)胞一旦沉淀，立即用10 ng/ml 12-O-十四烷?；?/span>horbol-l3-乙酸酯（PMA）處理24小時(shí)（1μl儲備溶液，總體積為4 ml）。

Day2：

1. 在PMA中活化的THP-1細(xì)胞24小時(shí)后在transwell插入物分化。

2. 通過添加2ml新鮮RPMI/FCS培養(yǎng)基來制備新的6孔板。

3. 然后從含有活化THP-1細(xì)胞的插入物中輕輕吸出含有PMA的培養(yǎng)基，并將插入物轉(zhuǎn)移到新的6孔板上

4. 然后將2ml RPMI/FCS培養(yǎng)基加入插入物中，并在處理前放置1小時(shí)。

5. 然后用所需的細(xì)胞因子混合物處理插入物：

5.1. M1分化可以通過用15 ng/ml脂多糖（LPS）（1.5μl儲備溶液轉(zhuǎn)化為4ml）或50 ng/ml IFN-γ（2μl儲備液轉(zhuǎn)化為4ml）處理來實(shí)現(xiàn)。

5.2. M2分化可以通過用25 ng/ml IL4和25 ng/ml IL13（1μl儲備溶液加入4 ml）聯(lián)合處理來實(shí)現(xiàn)。

未分化但活化的THP-1細(xì)胞在插入物中未經(jīng)處理以用作活化但未分化的單核細(xì)胞的參考孔。

在這個階段，可以通過免疫熒光、ELISA或特異性標(biāo)記物（如IL1、IL10、精氨酸酶）的基因表達(dá)分析來評估向M1和M2型巨噬細(xì)胞的正確分化。