血管生成不僅涉及包括癌癥生物學和非腫瘤疾病在內(nèi)的病理條件，還涉及包括生殖、發(fā)育和修復在內(nèi)的許多生物學過程。在血管生成過程中，內(nèi)皮細胞（EC）在血管生成因子與其受體結(jié)合、釋放蛋白酶以溶解基底膜、向血管生成信號遷移、增殖和細胞數(shù)量增加以形成新血管后發(fā)生激活。最后，內(nèi)皮細胞的重組形成了三維血管系統(tǒng)。HUVEC管形成測定法是一種簡單但公認的體外血管生成測定法，基于內(nèi)皮細胞在生長因子減少的基底膜提取物凝膠上培養(yǎng)時形成三維毛細管狀管狀結(jié)構(gòu)的能力。在測定過程中，內(nèi)皮細胞分化、定向遷移以排列、分支并形成血管的管狀多邊形網(wǎng)絡。

需要準備的試劑：

基質(zhì)膠（啟達生物，貨號：SD0054）

Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）（高糖L-谷氨酰胺，500毫升）

胎牛血清（啟達生物, 貨號：SD0200）

原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）（啟達生物, 貨號：CD0290）

ECGM內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基/套裝（啟達生物, 貨號：P1001）

ECGS（啟達生物，貨號：P1002）

條件培養(yǎng)基（CM）

備注：靶細胞系也可以是那些有或沒有藥物治療或表達感興趣基因的細胞系。

需要準備的耗材：

細胞培養(yǎng)箱

帶數(shù)碼相機的倒置顯微鏡（尼康TMS）

Scion Image軟件

96孔板

離心機

細胞計數(shù)器

T25細胞培養(yǎng)瓶

HUVEC成管操作protocol：

A. 從靶細胞系制備條件培養(yǎng)基

1. 為了制備條件培養(yǎng)基（CM），接種靶細胞并生長至30-40%匯合（取決于細胞系的生長速率），用無血清DMEM（例如，對于T75組織培養(yǎng)瓶為10ml；抗生素的存在與否無關(guān)緊要）2. 代替生長培養(yǎng)基24小時，然后當細胞在T75組織培養(yǎng)瓶中達到60-80%匯合時收獲CM。

如果收集CM后未立即使用，則取0.5 ml CM等分試樣，并在-80°C下儲存。

B.人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）細胞的制備

1. 按照培養(yǎng)基配比要求配好ECGM完全培養(yǎng)基。

2. 根據(jù)需要將HUVEC細胞接種在T25或T75培養(yǎng)瓶中，使其達到70-80%的融合。

3. 在不含抗生素的培養(yǎng)基200PRF中進行試管形成測定之前，去除血清使HUVEC細胞饑餓3-6小時（例如，對于T25組織培養(yǎng)瓶為5毫升）。

注：在血清饑餓結(jié)束時，轉(zhuǎn)至程序C步驟1。

4. 在用生長因子減少的基質(zhì)膠涂布96孔板后，用胰蛋白酶從燒瓶表面去除細胞，用DMEM與血清中和，在室溫下以1200rpm（276xg）離心3分鐘使細胞沉淀，重懸于2-3ml無血清DMEM中，通過計數(shù)細胞來測定HUVEC的濃度，并通過向上和向下吸移幾次以4×105/ml無血清DMEM重懸HUVEC細胞，以確保均勻的單細胞懸浮液。

注：對于生長因子減少的基質(zhì)膠，應盡可能減少解凍/冷凍周期。

5. 在將500μl HUVEC細胞懸浮液移液到1.5 ml試管中的同時充分混合。使用臺式離心機以4000rpm（1100rcf）的轉(zhuǎn)速將細胞降速3分鐘。在不干擾細胞沉淀的情況下小心地吸出上清液。盡可能多地去除上清液。根據(jù)要使用的靶細胞系的數(shù)量，在1.5ml試管中制備適當數(shù)量的HUVEC細胞。

注：每個靶細胞系CM將懸浮一管HUVEC，每個懸浮的HUVEC將分配3個一式三份的孔。因此，每個靶細胞系總共將使用3個孔。

6. 解凍從程序a步驟2收集的0.5ml等分的目標細胞系CM，并用胎牛血清將其補充至1%的最終濃度，以在程序B步驟5中重懸HUVEC細胞顆粒。

注：每個靶細胞系應一式三份（每個孔需要100μl HUVEC細胞懸浮液）。

C . 用生長因子減少的基質(zhì)膠（啟達生物，貨號SD0054）涂覆96孔板

1. 使用前一天在4°C下解凍適當體積的基質(zhì)膠。

2. 將96孔板和移液管尖端在-20°C下預冷2-3小時。

3. 在HUVEC細胞血清饑餓接近尾聲時，在計數(shù)HUVEC之前，在冰上預冷96孔板的每孔中，等分試樣50μl的基質(zhì)膠。旋轉(zhuǎn)鋪板，直到凝膠均勻地分布在整個孔上。避免氣泡的形成是非常重要的。使其在室溫下在水平表面上聚合1小時。

D. 將HUVEC細胞分配到涂布的96孔板上

1. 將100μl程序B步驟6中獲得的HUVEC細胞懸浮液完全混合到96孔板的標記孔中。將平板在37°C、5%CO2下培養(yǎng)4-6小時。

2. 用光學顯微鏡觀察細胞。拍攝毛細管網(wǎng)絡的圖像，并使用Scion Image軟件計算管道長度。

與CM孵育6小時（100x，100μm）后，HUVEC在基質(zhì)凝膠上成管。

參考文獻：

1.  Ko, J. M. and Lung, M. L. (2012). In vitro Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Tube-formation Assay. Bio-protocol 2(18): e260. DOI: 10.21769/BioProtoc.260.

2. Chan, K. C., Ko, J. M., Lung, H. L., Sedlacek, R., Zhang, Z. F., Luo, D. Z., Feng, Z. B., Chen, S., Chen, H., Chan, K. W., Tsao, S. W., Chua, D. T., Zabarovsky, E. R., Stanbridge, E. J. and Lung, M. L. (2011). Catalytic activity of Matrix metalloproteinase-19 is essential for tumor suppressor and anti-angiogenic activities in nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer 129(8): 1826-1837.

3. Kong, D., Li, Y., Wang, Z., Banerjee, S. and Sarkar, F. H. (2007). Inhibition of angiogenesis and invasion by 3,3'-diindolylmethane is mediated by the nuclear factor-kappaB downstream target genes MMP-9 and uPA that regulated bioavailability of vascular endothelial growth factor in prostate cancer. Cancer Res 67(7): 3310-3319.