腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)是一種常用的實(shí)驗(yàn)方法，用于研究腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性。原代培養(yǎng)是指從腫瘤組織中分離出的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的第一代細(xì)胞，具有與原始腫瘤組織相似的生物學(xué)特性，是研究腫瘤生物學(xué)的重要工具。

一、準(zhǔn)備試劑：

磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）(啟達(dá)貨號(hào)：SD0029),胎牛血清（需滅活）(啟達(dá)貨號(hào)：SD0200),胰蛋白酶，Hepes(啟達(dá)貨號(hào)：SD0009)，MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(啟達(dá)貨號(hào)：MD0300)，B-27細(xì)胞添加劑(啟達(dá)貨號(hào)：SD0011)，PSN抗生素(啟達(dá)貨號(hào)：SD0034)，多聚賴氨酸(啟達(dá)貨號(hào)：SD0042)

二、腫瘤細(xì)胞提取步驟：

1. 進(jìn)行腫瘤的離體大體全切除，在定性濾紙上去除血水以及包膜，使用眼科剪在少量的PBS中將組織切碎。

2. 在37°C的振蕩浴中，用每種樣品11 ml的消化酶（在含有20mM HEPES的MEM中，胰蛋白酶2.5%的1:1000稀釋液）處理切碎的組織30分鐘。消化后，通過(guò)70μm篩網(wǎng)過(guò)濾分離的細(xì)胞。

3. 加入5毫升10%熱滅活的FBS使胰蛋白酶失活。以450 x g離心細(xì)胞10分鐘，然后重新懸浮在含有20mM HEPES和10%的FBS的MEM中。

4. 將細(xì)胞以300X g離心20分鐘，然后重新懸浮在培養(yǎng)基中。

將腫瘤細(xì)胞平鋪到用聚-L-賴氨酸（0.1mg/ml濃度）以每孔200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的濃度涂布的6孔組織培養(yǎng)板上。

5. 使用相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基加10%FBS,1%B-27 和1%PSN培養(yǎng)細(xì)胞（原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)以DMEM高糖和McCoy's 5A基礎(chǔ)最為常見），并按照細(xì)胞生長(zhǎng)特性補(bǔ)加生長(zhǎng)因子

6. 從在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持48小時(shí)的腫瘤細(xì)胞系的融合培養(yǎng)物中收集該腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基。

三、注意細(xì)節(jié)，原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)就是這么簡(jiǎn)單：

(1)培養(yǎng)材料應(yīng)取自腫瘤細(xì)胞集中、活力較好的部分，取材后應(yīng)立即培養(yǎng)并存放于培養(yǎng)液中。

(2)取材和培養(yǎng)過(guò)程中要防止細(xì)菌和霉菌污染。

(3)培養(yǎng)物中混有的成纖維細(xì)胞要盡快清除。

(4)癌組織中若有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，應(yīng)采用梯度離心法將淋巴細(xì)胞清除，否則癌細(xì)胞會(huì)被殺死。

(5)實(shí)驗(yàn)要防止其他細(xì)胞株的交叉污染。

(6)當(dāng)癌細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足夠的量時(shí)，應(yīng)耐心等待，堅(jiān)持換液，不要急于傳代。

(7)癌細(xì)胞經(jīng)常重疊生長(zhǎng)，如果混有成纖維細(xì)胞，應(yīng)在傳代時(shí)采用消化消除法及反復(fù)貼壁法加以清除，分離出癌細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

(8)在傳到10代前細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖極不穩(wěn)定，傳代要小心，該合并培養(yǎng)時(shí)還得合并，千萬(wàn)不能傳代。要確定適合該細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

(9)在早期傳代時(shí)要適當(dāng)提高接種濃度。

(10)消除成纖維細(xì)胞始終為癌細(xì)胞培養(yǎng)中的重要條件，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)盡早盡快按上述介紹的方法加以清除。

參考文獻(xiàn)：

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