小鼠的微血管內(nèi)皮怎么提取和分離，以下是我們技術整理的資料，15只小鼠換來的經(jīng)驗之談，您有更好的操作方法嗎？歡迎后臺留言大家一起討論.

準備好ECGM內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（為了防止污染，可使用三抗進行初代培養(yǎng))（啟達生物：P1001）、細胞包被液（啟達生物： SD0044)含有2.5%FCS加三抗的PBS,磁珠抗體，細胞篩，胰蛋白酶，眼科剪，等等

1. 使用過量的異氟烷對老鼠實施安樂死。最好在一分鐘內(nèi)導致老鼠呼吸停止，時間太長會產(chǎn)生缺血灌注反應，導致提取的細胞內(nèi)血液細胞太多，正常內(nèi)皮無法獲取營養(yǎng)繁殖。  

2. 使用高壓滅菌儀器盡可能無菌地去除小鼠的心臟、肺和肝臟等器官，并在加入2X雙抗的PBS中沖洗以去除血液。 

3. 在培養(yǎng)皿中，使用無菌交叉手術刀，將需要提取的組織解剖成2mm3塊。 

4. 通過低速離心（210 x g，1分鐘）在PBS中洗滌兩次。 

5. 在37°C的潮濕培養(yǎng)箱中，將切片組織在膠原酶2溶液（0.5 mg/ml）中培養(yǎng)1小時。

注：我們使用Gibco?II型膠原酶，因為與其他膠原酶制劑相比，它具有更高的梭菌蛋白酶活性，非常適合消化心臟、骨骼、甲狀腺、軟骨和肝臟組織。

6. 隨后，每10 ml細胞懸浮液添加75μl DNase I溶液，并在37°C水浴中連續(xù)攪拌再孵育30分鐘。 

7. 將消化后的組織通過細胞過濾器，以去除未消化的塊。 

8. 用補充有2.5%FCS并且加雙抗的PBS沖洗細胞濾網(wǎng)兩次，以收集任何剩余的細胞。 

9. 在0.25%胰蛋白酶（每100mg組織用1ml胰蛋白酶）中再孵育10分鐘，獲得單細胞懸浮液。 

10. 在補充有2.5%FCS的500μl PBS中洗滌一次。 

11. 用鼠免疫球蛋白在4°C下孵育30分鐘以阻斷Fc受體。

注：小鼠BD-Fc塊是純化的大鼠IgG2b抗小鼠CD16/CD32單克隆抗體。

12. 在補充有2.5%FCS的冷PBS中洗滌兩次。 

13. 與大鼠抗小鼠CD31、大鼠抗鼠CD105和生物素化的隔離蛋白B4在4°C下孵育45分鐘。 

14. 在補充有2.5%FCS的冷500μl PBS中洗滌兩次，并計數(shù)細胞。 

15. 重新懸浮顆粒，并與PBS 2.5%FCS（200μl/l，2.5 x 107細胞）、大鼠抗小鼠Ig（25μl/l、2.5 x 107個細胞）和鏈霉親和素結(jié)合的微珠（25μl/l，2.5×107細胞）在4°C下孵育15分鐘（總體積250μl）。同時，將色譜柱加載到分離裝置上（每1-2.5 x 107個細胞使用一個色譜柱），并按照制造商的說明用500μl PBS 0.5%FCS清洗每個色譜柱。 

16. 將250μl細胞懸浮液裝入每個柱中。磁性標記的細胞保留在柱中，而未標記的細胞通過。細胞懸浮液流過柱后，用500μl PBS 0.5%FCS洗滌柱兩次。不同品牌的儀器請參閱儀器制造商網(wǎng)站上的視頻或者說明書。 

17. 將柱從磁鐵上卸下，并使用提供的柱塞用PBS 0.5%FCS洗脫磁性保留的細胞。 

18. 洗滌洗脫的細胞，以200 x g離心5分鐘。（在第一鋪板的時候，ECGM培養(yǎng)基的血清濃度可提高到10%左右），（10^5cell/ml）中再懸浮，并在用包被液預涂的培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。因ECGM培養(yǎng)基配方采用小分子化合物抑制雜細胞生長，采用蛋白誘導內(nèi)皮細胞生長，可以讓得到的內(nèi)皮細胞傳代更多并且純度也更高，培養(yǎng)15天發(fā)現(xiàn)在任何階段都沒有觀察到非內(nèi)皮來源的污染細胞的過度生長。此方法提取和培養(yǎng)微血管內(nèi)皮純度在95%以上。