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腫瘤原代的純化培養(yǎng)，你學(xué)會了嗎？
來源：啟達(dá)生物 瀏覽量：1563 發(fā)布時間：2023-09-14
腫瘤原代提取后總會發(fā)現(xiàn)有雜細(xì)胞在默默的生長，混雜的細(xì)胞會直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣才能對某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等變化進(jìn)行一系列研究，于是我們必須要將細(xì)胞進(jìn)行純化，以維持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)一性和可驗(yàn)證性。
因腫瘤本身保持的無規(guī)則與無限的生長性，克隆化純化法是腫瘤原代純化首選的方法，其分為：毛細(xì)管法、有限稀釋法 、平皿克隆分離法、軟瓊脂克隆分離法、單細(xì)胞顯微操作法等
1.毛細(xì)管法:
將一定量的細(xì)胞懸液（如1*10^5/mL或更低）稀釋至10個細(xì)胞/mL，取10mL稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm，長為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（30～50只），在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中，在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由一個細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后，并向管外擴(kuò)展，并形成單個克隆的細(xì)胞群體。
食管癌細(xì)胞初代培養(yǎng) 純化后的食管癌細(xì)胞
2.有限稀釋法：
（1）取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，測定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）。
（2）將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至50個細(xì)胞/mL、10個細(xì)胞/mL、5個細(xì)胞/mL，將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于37℃ 5%CO2下培養(yǎng)。
（3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加0.1mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
（4）培養(yǎng)期間，視pH值的變化決定是否換液或補(bǔ)加培養(yǎng)液，一周左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)，待長至孔底面的1/3～1/2時，可用消化法將96孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移至24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
3.平皿克隆分離法：
（1）將對數(shù)生長期細(xì)胞制備單個細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散，貼壁細(xì)胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）。
（2）將上述細(xì)胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1周或更長。若有明顯的克隆形成時方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：
① 套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況， 標(biāo)記單個克隆周邊，吸干培養(yǎng)基，用涂有少量無菌硅脂的無菌金屬套環(huán)，套住標(biāo)記的克隆，在套環(huán)內(nèi)滴加少量0.25%胰蛋白酶，待細(xì)胞脫離時，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉(zhuǎn)入小平皿或24孔板或6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。
② 玻片法：在接種細(xì)胞懸液前，預(yù)先在60mm平皿中放入無菌小玻片，加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng)一定時間后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記上含一個克隆的玻片，然后用無菌鑷子取出標(biāo)記玻片轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。
4.軟瓊脂克隆分離法：
此方法僅用于懸浮培養(yǎng)的類淋巴細(xì)胞或惡性程度高的貼壁細(xì)胞，比較好消化的細(xì)胞在軟瓊脂中不能形成克隆。
（1）將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單個細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個細(xì)胞)作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6細(xì)胞一升，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×10^4個細(xì)胞一升為佳。
（2）制備底層瓊脂取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂完全溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，待冷至50℃，迅速加入9份預(yù)溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用。
（3）制備上層瓊脂取37℃保溫的、不同濃度的細(xì)胞懸液9.4mL，移入小燒杯中，加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。
（4）于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長，若需培養(yǎng)更長時間可補(bǔ)加0.8mL/孔含瓊脂的培養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止。
（5）集落（克隆）計(jì)數(shù)：在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)直徑大于75μm或含有50個細(xì)胞以上的克隆。
5．單細(xì)胞顯微操作法
借助顯微操縱器，在顯微鏡監(jiān)控下將單個細(xì)胞逐個吸出，移入含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。本法準(zhǔn)確性好，如無顯微操縱器可自制毛細(xì)吸管替代
