黑色素細(xì)胞是黑色素產(chǎn)生細(xì)胞，存在于皮膚、內(nèi)耳、神經(jīng)系統(tǒng)和心臟中（李，2014）。黑色素細(xì)胞及其前體細(xì)胞，即黑色素母細(xì)胞，起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞。了解黑素細(xì)胞的個體發(fā)生是發(fā)育生物學(xué)中的一個關(guān)鍵領(lǐng)域，對人類健康具有重要意義，與黑素細(xì)胞譜系細(xì)胞缺陷相關(guān)的大量人類疾病就是明證。那么黑素細(xì)胞怎么分離？

首先第一步準(zhǔn)備好試劑:

黑素細(xì)胞，MM黑素細(xì)胞培養(yǎng)基（啟達(dá)生物，貨號:P5001）,胰酶，PBS，F(xiàn)ACS等

一、飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)：

1.將ST2細(xì)胞維持在ST2培養(yǎng)基中。處理來自T25組織培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)物的程序如下所述。所有步驟均在層流生物安全柜中無菌進行。

2.一旦ST2培養(yǎng)物達(dá)到80%匯合，通過抽吸去除生長培養(yǎng)基。

3.輕輕加入5 mL溫?zé)幔?7°C）無菌無Ca2+和無Mg2+的PBS，沖洗細(xì)胞單層并通過抽吸去除。

4.將細(xì)胞胰蛋白酶化，加入1mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，并將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

每隔2-4分鐘通過相差顯微鏡檢查細(xì)胞脫離的程度。

5.一旦約90%的細(xì)胞分離，加入7 mL溫?zé)幔?7°C）生長培養(yǎng)基使胰蛋白酶失活，并輕輕混合細(xì)胞懸浮液以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。

6.將1 mL細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到含有5 mL溫?zé)幔?7°C）生長培養(yǎng)基的新T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。輕輕混合，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中。

7.為了保持指數(shù)細(xì)胞增殖，每三天抽吸一次生長培養(yǎng)基，并用5mL新鮮生長培養(yǎng)基代替。不要讓培養(yǎng)物達(dá)到80%以上的融合。

二、制備飼養(yǎng)層細(xì)胞

1.將在T25燒瓶中培養(yǎng)的ST2細(xì)胞胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL錐形管中。

2.將細(xì)胞在22°C下以200×g離心5分鐘。吸取上清液，將細(xì)胞沉淀輕輕重懸于1 mL溫?zé)幔?7°C）RPMI生長培養(yǎng)基中。

3.使用血細(xì)胞儀測定細(xì)胞密度，并通過添加適當(dāng)體積的溫?zé)酭PMI生長培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至70000個細(xì)胞/mL。

4.將100μL細(xì)胞懸浮液添加到放置在35mmμ皿中的4孔插入物的每個孔中（7000 ST2細(xì)胞/孔），并培養(yǎng)過夜。

注：使用光學(xué)級塑料的μ-培養(yǎng)皿可以實現(xiàn)高質(zhì)量成像和最佳的細(xì)胞附著和擴散。

5.鋪板后的第二天，在分離和純化靶向黑色素母細(xì)胞（見下文）之前，通過抽吸去除ST2生長培養(yǎng)基。

6.向每個孔中加入100μL由黑素細(xì)胞生長培養(yǎng)基和ST2-RPMI生長培養(yǎng)基的1:1混合物組成的溫暖（37°C）新鮮培養(yǎng)基。

7.將ST2飼養(yǎng)細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中。

三、目的胚胎黑色素母細(xì)胞的分離

1. 單劑量IP給藥他莫昔芬四天后（步驟B4），按照適當(dāng)?shù)臋C構(gòu)批準(zhǔn)的動物護理倫理程序，通過吸入二氧化碳或過量使用異氟烷，在15.5 dpc時對妊娠期母鼠實施安樂死。

2.將動物仰臥在吸收墊上，用70%乙醇浸泡胸部和腹部。

3.用鉗子輕輕向外捏腹部中心以下的腹部皮膚，并用外科剪刀在中線上做一個小切口，確保不會切開腹腔。沿著腹部中線切開皮膚，輕輕地將皮膚拉向兩側(cè)，使其與下面的腹腔分離，從而露出子宮（圖1）。

4.用鉗子輕輕地將含有一串胚胎的子宮從體腔中取出。將子宮轉(zhuǎn)移到含有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，保持室溫（22°C）。通過沿著子宮角在植入部位之間仔細(xì)切割來分離胚胎（圖1）。

5.胚胎分離是在立體顯微鏡下進行的。為此，將單個胚胎和相關(guān)的子宮組織轉(zhuǎn)移到另一個含有PBS的培養(yǎng)皿中。將胚胎保存在PBS中，用鑷子從胚胎上剝離肌肉子宮層，然后去除蛻膜和胎盤外錐。

6.用鉗子輕輕撕裂卵黃囊，輕輕撕裂臍帶，使其與胚胎完全分離。

7.將胚胎轉(zhuǎn)移到含有PBS的無菌組織培養(yǎng)皿中，并置于冰上。在這個階段，可以去除胚胎尾部的一小段，并在必要時進行基因組DNA提取和基因分型處理（圖1）

8.將胚胎轉(zhuǎn)移到放置在立體顯微鏡臺上的含有無菌PBS的培養(yǎng)皿中。

9.用鉗子將胚胎保持在俯臥位，用手術(shù)刀在頭部下方沿著中線輕輕地在整個胎體上做一個淺的縱向背側(cè)切口，避免造成器官暴露的深切口。

10.使用剪刀，從最靠近頸部的切口點開始，輕輕地逐漸將皮膚與尸體分離。

注意：胚胎皮膚非常脆弱。用一把鉗子通過胚胎的頭部夾住胚胎，用另一把鉗子輕輕地將皮膚與胎體分離。

11.將每個收獲的皮膚漂浮在含有冰冷無菌PBS的無菌培養(yǎng)皿中。繼續(xù)采集所有剩余胚胎的皮膚。

12.用鑷子小心地將胚胎皮膚轉(zhuǎn)移到無菌錐形管中，每個皮膚含有500μL無菌2.5%胰蛋白酶。

注：如果需要對單個胚胎進行分析，可以在含有500μL 2.5%胰蛋白酶的2mL微型試管中消化每個皮膚，然后切碎。

13.用小剪刀將皮膚切成約2毫米×2毫米的碎片，并在37°C下輕輕搖動孵育10分鐘后，肉眼觀察皮膚基本已經(jīng)完成消化成絮狀物，加入1mL胰蛋白酶中和溶液，輕輕混合。

14.通過40μm孔徑的無菌細(xì)胞過濾器將細(xì)胞懸浮液過濾到15mL無菌錐形管中，以去除組織碎片。

15.為了獲得單細(xì)胞懸浮液，將過濾的細(xì)胞混合物輕輕地通過裝有21G針的5或10mL注射器10次，在22°C下以140×g離心5分鐘。

16.通過抽吸小心地去除上清液，避免干擾細(xì)胞沉淀。

17.在300–500μL冰冷的FACS分選緩沖液中重新懸浮胚胎細(xì)胞。

注：在較大體積的FACS分選緩沖液中重新懸浮細(xì)胞將導(dǎo)致流速降低和分選時間增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。

18.將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到5 mL BD Falcon玻璃管中，并置于冰上。

19.立即進行黑色素母細(xì)胞的細(xì)胞染色和FACS純化。

20.將細(xì)胞分類到含有冰冷黑素細(xì)胞培養(yǎng)基的無菌管中。

21.在分選機中對分選的細(xì)胞懸浮液進行小份等分，用蓋子密封含有剩余分選黑色素母細(xì)胞的試管，并將其輸送到細(xì)胞培養(yǎng)房進行后續(xù)播種。

22.將分選的GFP陽性黑色素母細(xì)胞接種到含有先前制備的ST2飼養(yǎng)細(xì)胞融合單層的35mmμ-培養(yǎng)皿的插入孔中（D部分），并在37°C下培養(yǎng)。

注：每個胚胎獲得的GFP陽性黑色素母細(xì)胞的平均數(shù)量約為500（范圍從50到1400）。從4-8個胚胎中獲得的黑色素母細(xì)胞可以合并到一個孔中。

23.分選16小時后，用移液管輕輕移走吸取的生長培養(yǎng)基，以避免干擾細(xì)胞單層，并用新鮮的生長培養(yǎng)液代替。

注：接種16小時后，約70%的黑色素母細(xì)胞將完全擴散并開始表現(xiàn)出樹枝狀（如下圖）。

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