血管新生（Angiogenesis），又稱為血管生成或血管發(fā)生，是指在原先存在的血管的基礎(chǔ)上生出新的血管的生理學(xué)過程，血管新生主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖種，血管新生有多少種檢測方法？以下是從一篇文獻(xiàn)中找到的31種檢測方法。

以下是兩種常用的血管新生的實(shí)驗(yàn)檢測操作步驟：

1.MTT法檢測內(nèi)皮細(xì)胞活性

貼壁細(xì)胞 

1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入 100ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至 1000-10000 孔，（邊緣 孔用無菌 PBS 填充）。 

2.5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96 孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后 即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般 5-7 個梯度,每孔 100ul,設(shè) 3-5 個復(fù)孔.建議設(shè) 5 個，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況 。

3.5%CO2，37℃孵育 16-48 小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 

4.每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng) 4h。若藥物與 MTT 能夠反應(yīng)，可先離心后 棄去培養(yǎng)液，小心用 PBS 沖 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培養(yǎng)液。 

5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 

6.每孔加入 150ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀 OD490nm 處測量各孔的吸光值。

7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、 MTT、二甲基亞砜）。

懸浮細(xì)胞：

1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度 1×106/ml，按次序?qū)?/p>

①補(bǔ)足的 1640（無血清）培養(yǎng)基 40ul ；

② 加 Actinomycin D（有毒性）10ul 用培養(yǎng)液稀釋 l?g/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；

③需檢測物 10ul； 

④細(xì)胞懸液 50ul（即 5×104cell/孔），共 100ul 加入到 96 孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加 100?(儲 存液 100 1640）。 

2.置 37℃，5%CO2 孵育 16-48 小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。 

3.每孔加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用 WST-1，培養(yǎng) 4 h 后可跳過步驟 4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀 OD570nm（630nm 校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）。

4.離心（1000 轉(zhuǎn) x10min），小心吸掉上清，每孔加入 100 ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使 結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀 OD570nm（630nm 校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。 

5.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、 MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定 3 復(fù)孔。

二、內(nèi)皮細(xì)胞的成管實(shí)驗(yàn)操作步驟：以HUVEC細(xì)胞為例

提前預(yù)冷分裝基質(zhì)膠所需要的耗材，在冰上4°C 解凍基底膜基質(zhì)，解凍后使用酒精擦拭消毒，置于冰上分裝或者操作，使用前搖勻。

A. 從靶細(xì)胞系制備條件培養(yǎng)基

1. 為了制備條件培養(yǎng)基（CM），接種靶細(xì)胞并生長至30-40%匯合（取決于細(xì)胞系的生長速率），用無血清DMEM（例如，對于T75組織培養(yǎng)瓶為10ml；抗生素的存在與否無關(guān)緊要）

2. 代替生長培養(yǎng)基24小時(shí)，然后當(dāng)細(xì)胞在T75組織培養(yǎng)瓶中達(dá)到60-80%匯合時(shí)收獲CM。

如果收集CM后未立即使用，則取0.5 ml CM等分試樣，并在-80°C下儲存。

B.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞的制備 

1. 按照培養(yǎng)基配比要求配好ECGM完全培養(yǎng)基。

2. 根據(jù)需要將HUVEC細(xì)胞接種在T25或T75培養(yǎng)瓶中，使其達(dá)到70-80%的融合。

3. 在不含抗生素的培養(yǎng)基200PRF中進(jìn)行試管形成測定之前，去除血清使HUVEC細(xì)胞饑餓3-6小時(shí)（例如，對于T25組織培養(yǎng)瓶為5毫升）。

注：在血清饑餓結(jié)束時(shí)，轉(zhuǎn)至程序C步驟1。

4. 在用生長因子減少的基質(zhì)膠涂布96孔板后，用胰蛋白酶從燒瓶表面去除細(xì)胞，用DMEM與血清中和，在室溫下以1200rpm（276xg）離心3分鐘使細(xì)胞沉淀，重懸于2-3ml無血清DMEM中，通過計(jì)數(shù)細(xì)胞來測定HUVEC的濃度，并通過向上和向下吸移幾次以4×105/ml無血清DMEM重懸HUVEC細(xì)胞，以確保均勻的單細(xì)胞懸浮液。

 注：對于生長因子減少的基質(zhì)膠，應(yīng)盡可能減少解凍/冷凍周期。

5. 在將500μl HUVEC細(xì)胞懸浮液移液到1.5 ml試管中的同時(shí)充分混合。使用臺式離心機(jī)以4000rpm（1100rcf）的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞降速3分鐘。在不干擾細(xì)胞沉淀的情況下小心地吸出上清液。盡可能多地去除上清液。根據(jù)要使用的靶細(xì)胞系的數(shù)量，在1.5ml試管中制備適當(dāng)數(shù)量的HUVEC細(xì)胞。

 注：每個靶細(xì)胞系CM將懸浮一管HUVEC，每個懸浮的HUVEC將分配3個一式三份的孔。因此，每個靶細(xì)胞系總共將使用3個孔。

6. 解凍從程序a步驟2收集的0.5ml等分的目標(biāo)細(xì)胞系CM，并用胎牛血清將其補(bǔ)充至1%的最終濃度，以在程序B步驟5中重懸HUVEC細(xì)胞顆粒。

 注：每個靶細(xì)胞系應(yīng)一式三份（每個孔需要100μl HUVEC細(xì)胞懸浮液）。

C . 用生長因子減少的基質(zhì)膠（啟達(dá)生物，貨號SD0054）涂覆96孔板

1. 使用前一天在4°C下解凍適當(dāng)體積的基質(zhì)膠。

2. 將96孔板和移液管尖端在-20°C下預(yù)冷2-3小時(shí)。

3. 在HUVEC細(xì)胞血清饑餓接近尾聲時(shí)，在計(jì)數(shù)HUVEC之前，在冰上預(yù)冷96孔板的每孔中，等分試樣50μl的基質(zhì)膠。旋轉(zhuǎn)鋪板，直到凝膠均勻地分布在整個孔上。避免氣泡的形成是非常重要的。使其在室溫下在水平表面上聚合1小時(shí)。

D. 將HUVEC細(xì)胞分配到涂布的96孔板上

1. 將100μl程序B步驟6中獲得的HUVEC細(xì)胞懸浮液完全混合到96孔板的標(biāo)記孔中。將平板在37°C、5%CO2下培養(yǎng)4-6小時(shí)。

2. 用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞。拍攝毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的圖像，并使用Scion Image軟件計(jì)算管道長度。