一、標(biāo)準(zhǔn)方法：Ficoll-泛影鈉（Ficoll-Hypaque）密度梯度及紅細(xì)胞裂解法

(1）取一50ml聚乙烯管，無菌采集人外周靜脈血，加4.4ml3.8%或5%的檸檬酸鹽液定容至40ml。上述全血300gX20min，離心，室溫。

(2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無血小板血漿（platelet-poor Plasma, PPP）。

(3）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用無菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調(diào)節(jié)最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。

(4）吸出富含白細(xì)胞的上層液，275gX6min。

(5）沉淀的細(xì)胞用8mlPPP-生理鹽水（1：4）重懸，并移到15ml離心管中。

(6）懸液細(xì)胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室溫。

(7）吸取富含中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞層，用0.155M　NH4Cl重懸細(xì)胞，使紅細(xì)胞裂解，然后中性粒細(xì)胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，無鈣）洗2次，最終用HBSA（含鈣）重懸。

(8）用此法可得95%以上的中性粒細(xì)胞。

二、不連續(xù)的密度梯度血漿－Percoll離心法

(1）先制備Percoll儲(chǔ)存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的體積比為9：1。

(2）取一50ml聚乙烯管，無菌采集人外周靜脈血，加4.4ml3.8%或5%的檸檬酸鹽液定容至40ml。上述全血300gX20min，離心，室溫。

(3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無血小板血漿（platelet-poor Plasma, PPP）。

(4）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用無菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調(diào)節(jié)最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。

(5）吸出富含白細(xì)胞的上層液，275gX6min。

(6）沉淀的細(xì)胞用2~3mlPPP重懸。

(7）在一15ml離心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均為用PPP新鮮配制)、2~3ml細(xì)胞懸液，275gX10min。

(8）單個(gè)核細(xì)胞及部分血小板位于血漿與42%Percoll液之間，中性粒細(xì)胞位于42%Percoll與51%Percoll之間。血小板可通過 25%Percoll離心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三個(gè)25%Percoll一起離心去除。

(9）中性粒細(xì)胞層用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸緩沖液（KRPD，PH7.23）洗1次。

(10）用這種方法可得80%中性粒細(xì)胞，純度在95%以上。

三、“無LPS”方法（LPS-Free method)

(1）已有用變形細(xì)胞（如白細(xì)胞）裂解的方法表明，容器及溶液的不含LPS，也就是說，LPS的含量小于 0.1ng/ml。

(2) 無菌采集靜脈血，用10%檸檬酸鈉抗凝。

(3）抗凝血中加入6%的Dextran(mol wt 70,000)，比例為3：1（vol/vol,blood/dextran），室溫，1小時(shí)。

(4) 收集白細(xì)胞的血漿，離心，去上清。

(5）紅細(xì)胞用低滲的0.2%NaCl裂解15秒（此步也可用0.155M　NH4Cl　15秒代替）。

(6）離心前立即加入10ml 1.6%NaCl（含糖(dextrose) 2mg/ml）。

(7) 離心后用KRPD洗2次。

(8）此法得到中性細(xì)胞數(shù)與方法2類似，但純度只有80-85%，余下為淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞。

4、從3中所獲得的中性粒細(xì)胞進(jìn)行純化

(1）因?yàn)榉椒?只能獲得80－85%純度的中性粒細(xì)胞，可以把方法2與方法3聯(lián)合對中性粒細(xì)胞進(jìn)行純化。

(2）收集從方法3 dextran沉降所得到的富含白細(xì)胞的血漿，275g*6min，離心。

(3）管底沉淀用2ml PPP重懸。

(4）在一15ml離心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均為用PPP新鮮配制)、2~3ml細(xì)胞懸液，275gX10min。

(5）分別用PPP及KRPD各洗1次。

(6）用這種方法所得的中性粒細(xì)胞純度高達(dá)99%以上，并且中間不需要紅細(xì)胞裂解的步驟。

krebs-Ringer phosphate（KRPD緩沖液）的配制：

130 mM NaCl, 5mM KCl, 1.27 mM MgSO4, 0.95 mM CaCl2, 5 mM glucose, 10 mMNaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4

配制方法：

A液：NaCl　7.5985g ; KCl 0.3727g ; CaCl2 0.1054g，glucose-H2O 0.9495g, 加ddH2O 100ml溶解；

B液：NaH2PO4-2H2O 0.2964g Na2HPO4-12H2O 2.9011g，加100mlddH20溶解后加入MgSO4-7H2O　0.3130g，充分溶解。

將A、B混合，用ddH20將體積調(diào)節(jié)至990ml左右，用1M NaOH或1M HCl調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4，定容至1000ml。