做好的類器官該如何染色 ，讓它不僅美美噠還符合您實驗的要求，按照以下操作來：

冷凍和嵌入:

1.切掉P200ul尖端，將類器官移到1.5ml Eppendorf管中;

2.取出培養(yǎng)基，用1ml PBS洗滌兩次;

3.在4攝氏度的搖床上，在冷的4%PFA中固定30分鐘;

4.用1ml PBS洗滌三次;

5.向試管中加入1ml 30%蔗糖，在4C下孵育1小時或直 到類器官沉淀到底部;

6.在培養(yǎng)過程中，使用雙層鋁箔制備模具;

7.制備乙醇：干冰漿;

8.除去蔗糖，用1ml PBS洗滌一次;

9.切斷P200尖端的尖端。將P200移液器設定為100ul;

10.在P200尖端涂上FBS。一次撿起所有的類器官，讓 它們沉淀到尖端的底部。輕輕地按下移液管節(jié)流閥，直到類器官在切割尖端的底部聚集成液滴;

11.輕輕地將液滴接觸到鋁箔模具的底部。類器官應該粘在一起，你應該使進入模具的PBS的量最小化。如果PBS過多，請使用P200小心去除多余的PBS;

12.切掉P1000的尖端。將900ul OCT/30%蔗糖混合物（2份OCT/1份30%蔗糖）加入含有類有機物的鋁箔模具;

13.使用P200尖端，使OCT/30%蔗糖混合物中的類有機物旋轉。這稀釋PBS并分離類器官彼此分離;

14.將模具放入乙醇中：干冰漿，確保乙醇不會進入模具。OCT應冷凍并在兩分鐘內變成亮白色;

15.將模具放入24孔板中，在-80攝氏度下儲存，直到切片。一旦切片，您可以PFA修復小于5以下。

免疫染色準備：

1.使用PAP筆勾勒各部分的輪廓。讓其干燥1-2分鐘；

2.在室溫下，用4%PFA在玻璃室內固定切片5分鐘；

3.在玻璃室中用1X PBS在RT下洗滌3次，持續(xù)5分鐘；

4.在室溫下，在加濕室中封閉/滲透1小時，封閉液配方如下：

a.50ml PBS中的10%滅活的馬血清

b.0.38g甘氨酸

c.150ul Triton X-100

d.1滴Image-IT信號增加劑

5.在PBS中的1%滅活馬血清中添加第一抗體。在室溫下培養(yǎng)1小時或在4C下震蕩；

6.在1X PBS+0.05%TritonX-100的玻璃室中洗滌3x5分鐘；（a.100 ml PBS，b.500uL 10%TritonX-100）

7.在1%滅活馬血清+1:1000 DAPI中加入二抗，在RT下振蕩2-3小時；

8.在1X PBS+0.05%TritonX-100的玻璃室中洗滌3x5分鐘；

9.在1X PBS中洗滌2到5分鐘；

10.拿出進行短暫干燥。向每種類有機物中加入50-100uL的Fluoromount，并加入蓋玻片。使用透明的指甲油密封。

開始染色：

1.從培養(yǎng)箱中取出細胞，用1X PBS輕輕洗滌一次（150ul用于96孔板，500ul用于24孔板）。如果細胞沒有牢固地附著在培養(yǎng)皿上，則手動抽吸，而不是使用真空；

2.向每個孔中加入4%PFA（對于96孔板為50ul，對于24孔板為400ul），并在室溫下孵育15分鐘；

3.向每個孔中加入1X PBS（96孔板為150ul，24孔板為1ml）以稀釋PFA。然后清洗三次用1X PBS完全去除PFA；

4.加入0.1%Triton（50μl用于96孔板，400μl用于24孔板）使細胞透化并孵育10分鐘；

5.去除0.1%Triton，加入封閉溶液（在1X PBS中稀釋的10%正常驢血清；50ul用于96孔板，400ul用于24孔板）在室溫下攪拌1小時；

6.取出封閉溶液，加入在封閉溶液中稀釋的一抗（96孔板30ul，300ul對于24孔板）。在4攝氏度下培養(yǎng)過夜；

7.用1X PBS孔洗滌三次（96孔板為150ul，24孔板為1ml）；

8.加入在封閉溶液中稀釋的第二抗體，并在室溫下在黑暗中孵育1-2小時；

9.用1X PBS洗滌一次（96孔板為150ul，24孔板為1ml）；

10.加入DAPI溶液（在1X PBS中1:10000；50ul用于96孔板，400ul用于24孔板）并在黑暗中孵育持續(xù)5分鐘；

11.用1X PBS孔洗滌兩次（96孔板為150ul，24孔板為1ml）；

12.樣品現(xiàn)在可以成像了。如果細胞在蓋玻片上，現(xiàn)在可以將其放置在滑動的鏡頭下拍攝。