外周血單個核細胞（Peripheral  Blood  Mononuclear  Cell，簡稱PBMC）是存在于人體外周血液中的一種具有單個核的細胞類型。它們在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關重要的作用，主要包括淋巴細胞（Lymphocyte）、單核細胞（Monocyte）、樹突狀細胞（DC）等，同時還包括其他少量細胞。

一、準備材料：

在進行PBMC提取之前，需要準備以下材料：

1.人全血；

2.15ml離心管；

3.DPBS；

4.PBMC細胞分離液（啟達生物，catlog:SD0060）；

5.PBMC無血清細胞培養(yǎng)基(啟達生物，Catlog：P1901）。

二、PBMC細胞提取步驟：

1. 將 10ml 全血轉入 50ml 離心管中，加入 10ml PBS 溶液稀釋，輕輕混勻；

2. 取兩支 15ml 離心管，先加入 5ml 淋巴細胞分離液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的立板細胞分離液的上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各 10ml 稀釋血液； 

3. 2,000rpm，20min，注意，降速設置中一定要設置成 no break，或者只有 1-2 成的制動。離心完畢將得到如圖所示分層； 

4. PBMC 所在細胞層為白色。此時可以用吸管將該層細胞吸取在另一干凈的 15ml 離心管中。

5. 加入 PBS 至 10-15ml，1,500rpm，10min 離心后去掉上清，再加入培養(yǎng)基進行相同操作的清洗；

6. 加入 5-10ml 培養(yǎng)基重懸細胞，進行后續(xù)計數(shù)培養(yǎng)或者鋪板。

若實驗需要的細胞量較少， 可以把多余的細胞凍存，按照原代細胞凍存步驟凍存即可。

三、分離PBMC細胞需要注意的事項：

1. 每毫升外周血液大約可獲 1×106 單個核細胞；

2. Ficoll 應適量，外周血應充分稀釋，溫度直接影響到 Ficoll 的比重和分離效果；

3. 在 Ficoll 上加入稀釋外周血時，應緩慢加，以免沖散界面；

4. 吸取單個核細胞層時，應避免吸出過多的上清液或分層液而導致血小板污染。

在進行PBMC細胞分離時，我們需要關注以上四個方面：細胞數(shù)量的估算、Ficoll和外周血的配比、溫度控制、以及吸取細胞時的操作技巧。只有做到這四點，我們才能確保實驗的順利進行，獲得準確的實驗結果。