我和CCK-8實(shí)驗(yàn)的交情

實(shí)驗(yàn)之前老板都會(huì)說，要是沒有想好就先點(diǎn)個(gè)CCK8吧，于是CCK8成了實(shí)驗(yàn)的首選；

先說明一下CCK8的來歷：

CCK-8實(shí)驗(yàn)，全稱為Cell Counting Kit-8實(shí)驗(yàn)，是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法。該實(shí)驗(yàn)方法起源于對(duì)細(xì)胞增殖和毒性分析的需求，旨在提供一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確且靈敏度高的檢測(cè)手段。

CCK-8實(shí)驗(yàn)的主要原理基于其試劑盒中的核心成分——WST-8（化學(xué)名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）。關(guān)于WST-8在CCK-8試劑中的濃度，這通常是由試劑制造商根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和優(yōu)化結(jié)果來確定的，不同的商業(yè)CCK-8試劑盒中WST-8的濃度可能有所不同。

在活細(xì)胞中，WST-8能夠被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan）。這種產(chǎn)物的生成量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此，通過測(cè)量反應(yīng)后溶液的顏色深淺，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量和增殖情況。

CCK-8實(shí)驗(yàn)具有多種優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、靈敏度高、線性范圍寬、數(shù)據(jù)可靠且重現(xiàn)性好等。此外，CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的毒性較小，無需使用放射性同位素和有機(jī)溶劑，因此更加安全環(huán)保。這使得CCK-8實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如細(xì)胞增殖速率比較、材料毒性評(píng)價(jià)、新藥篩選、腫瘤藥敏試驗(yàn)等。

CCK-8怎么做？具體的操作步驟來啦：

一、細(xì)胞數(shù)量測(cè)定

1.將細(xì)胞懸浮液（100μL/孔）接種在96孔板中。在加濕的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)平板（例如，在37°C、5%CO2下）。

2.向板的每個(gè)孔中加入10μL CCK8溶液。小心不要將氣泡引入井中，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾外徑讀數(shù)。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。

4.使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度。

二、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.在100μL待測(cè)培養(yǎng)基中以10^3-10^4個(gè)細(xì)胞/孔的密度在96孔板中接種種子細(xì)胞，將細(xì)胞在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

2.將不同濃度的待測(cè)物質(zhì)加入板中。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如6、12、24或48小時(shí)）。

4.使用重復(fù)移液器向板的每個(gè)孔中加入10μL CCK8溶液。小心不要將氣泡引入井中，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾外徑讀數(shù)。

5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。

6.在讀取印版之前，重要的是在軌道振蕩器上輕輕混合1分鐘，以確保顏色均勻分布。

7.使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度。

三、數(shù)據(jù)分析

有幾種方法可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。您可以選擇使用O.D.值或單元格編號(hào)，如下是我常用的一個(gè)計(jì)算方式：

細(xì)胞存活率（%）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（%）=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As=實(shí)驗(yàn)孔的吸光度（細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK8和測(cè)試化合物孔的吸光度）。

Ab=空白孔吸光度（含有培養(yǎng)基和CCK8的孔的吸光度）。

Ac=對(duì)照孔吸光度（含有細(xì)胞、培養(yǎng)基和CCK8的孔的吸光度）。

四、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.使用培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸浮液稀釋至濃度梯度，通常需要5-7個(gè)濃度梯度，每組幾個(gè)重復(fù)孔。我一般重復(fù)3個(gè)，然后接種細(xì)胞。（注意每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)量。如果你在離心管中稀釋細(xì)胞懸浮液，在加入孔板之前，需再次混勻。每個(gè)孔中細(xì)胞懸浮液的體積應(yīng)該相同。）

3.孵育至細(xì)胞貼壁（通常2-4小時(shí)），然后每100μl培養(yǎng)基加入10μl CCK8。繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度。以單元格數(shù)量為X軸坐標(biāo)，外徑值為Y軸坐標(biāo)，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

小提醒一下：待測(cè)試樣品的細(xì)胞數(shù)量可以根據(jù)曲線確定。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的先決條件是培養(yǎng)條件相同。

T24穩(wěn)轉(zhuǎn)株CCK-8檢測(cè)，檢測(cè)濃度單位為ug/ml

CCK-8實(shí)驗(yàn)的坑要避一下，雖然條條大路通羅馬，我們不能在去往羅馬的路上掉坑里摔自己

1.確保藥物和CCK8在培養(yǎng)基中均勻分布。

2.細(xì)胞增殖越多，顏色越深；細(xì)胞毒性越強(qiáng)，顏色越淺。

3.對(duì)于貼壁細(xì)胞，每孔至少1000個(gè)細(xì)胞（100μl培養(yǎng)基）。對(duì)于白細(xì)胞，由于其低靈敏度，每孔（100μl培養(yǎng)基）至少需要2500個(gè)細(xì)胞。推薦的96孔板每孔的最大細(xì)胞數(shù)為25000。如果使用24孔或6孔板進(jìn)行測(cè)試，則計(jì)算每孔的相應(yīng)細(xì)胞數(shù)量，并將CCK8的體積調(diào)整為每孔總液體體積的10%。

4.由于CCK8測(cè)定基于活細(xì)胞中的脫氫酶活性，因此影響脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致活細(xì)胞的實(shí)際數(shù)量與使用CCK8測(cè)量的活細(xì)胞數(shù)量之間的差異。

5.WST-8可以與還原劑反應(yīng)形成WST-8甲氮。如果使用還原劑（如一些抗氧化劑），它會(huì)干擾測(cè)試。如果待測(cè)系統(tǒng)中存在更多的還原劑，則有必要將其清除。

6.孵育2小時(shí)后，背景O.D.值通常為0.1-0.2單位。

7.注意不要將氣泡引入孔中，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾外徑值。

8.如果要對(duì)CCK8溶液進(jìn)行消毒，請(qǐng)使用0.2μm的膜過濾溶液。

9.孵育時(shí)間將根據(jù)孔中細(xì)胞的類型和數(shù)量而變化。一般來說，白細(xì)胞顏色較淺，可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間（長(zhǎng)達(dá)4小時(shí)）或大量的細(xì)胞（約105個(gè)細(xì)胞/孔）。

10.如果細(xì)胞懸浮液中有高濁度，測(cè)量并減去樣品在600 nm或更高波長(zhǎng)下的O.D值。

11.CCK8不能用于細(xì)胞染色。

12.培養(yǎng)基中的酚紅不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)算時(shí)，可以通過減去空白孔中背景的吸光度來消除酚紅的吸光度，因此不會(huì)影響檢測(cè)。

13.CCK8的毒性很低。CCK8測(cè)定完成后，相同的細(xì)胞可用于其他細(xì)胞增殖測(cè)定，如結(jié)晶紫測(cè)定、中性紅測(cè)定或DNA熒光測(cè)定。（除非細(xì)胞極為罕見，否則不建議使用。）

14.CCK-8試劑盒可用于大腸桿菌，但不能用于酵母菌等真菌的檢測(cè)。

15.在檢測(cè)孔板之前，你可以在搖床上輕輕搖一下30S也足夠。

16.我們建議在平板中心附近的孔中接種細(xì)胞。最外圈孔中的介質(zhì)很容易蒸發(fā)，可以用PBS、水或介質(zhì)填充。

17.如果你沒有450nm濾光片。您還可以使用吸光度在430至490 nm之間的濾光片，以及450 nm濾光片以獲得最佳靈敏度。

18.測(cè)量450nm處的吸光度。如果需要進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)量，可以將650nm處的吸光度確定為參考波長(zhǎng)。

19.藥物中金屬離子的存在可能會(huì)影響CCK8的敏感性。終濃度為1mM的氯化鉛、氯化鐵和硫酸銅抑制了5%、15%和90%的顯色反應(yīng)，降低了靈敏度。如果最終濃度為10mM，它將被100%抑制.

實(shí)驗(yàn)證明CCK-8的靈敏度比MTS、MTT靈敏度都要高：

實(shí)驗(yàn)證明只有CCK-8才能讓細(xì)胞存活更長(zhǎng)：

附帶WST-8吸光光譜：

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