G418和嘌呤霉素在細(xì)胞篩選中怎么選擇？

G418和嘌呤霉素在化學(xué)性質(zhì)、作用機(jī)制及在生物學(xué)研究中的應(yīng)用等方面存在顯著差異。

G418，是一種氨基糖苷類抗生素。它主要通過干擾核糖體的功能來阻斷細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，從而對原核和真核細(xì)胞產(chǎn)生毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞等。在分子遺傳試驗(yàn)中，G418是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后，能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得對G418的抗性能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。

而嘌呤霉素則是一種氨基核苷類抗生素，是原核和真核生物中蛋白質(zhì)翻譯的有效抑制劑。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)與tRNA分子末端類似，能夠同氨基酸結(jié)合，代替氨?；?/span>tRNA同核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合，并摻入到生長的肽鏈中。然而，嘌呤霉素雖然能同A位點(diǎn)結(jié)合，卻不能參與隨后的任何反應(yīng)，這會導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。由于嘌呤霉素對原核和真核生物的翻譯過程均有干擾作用，因此它主要被用作研究蛋白質(zhì)合成的生物化學(xué)工具。

因此：G418主要通過干擾核糖體功能來阻斷蛋白質(zhì)合成，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的抗性篩選；在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面應(yīng)用。

而嘌呤霉素則通過模擬tRNA分子末端來抑制蛋白質(zhì)翻譯過程，主要用于研究蛋白質(zhì)合成的生物化學(xué)工具及篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

G418和嘌呤霉素篩怎么篩選呢？

篩選步驟來啦！

一、G418篩選操作：
1.制備篩選培養(yǎng)基：確定G418的最佳篩選濃度需要考慮細(xì)胞類型、生長條件以及其他環(huán)境因素，并通過實(shí)驗(yàn)來確定具體的濃度范圍，在細(xì)胞進(jìn)行慢病毒感染前用不同濃度的G418培養(yǎng)細(xì)胞：

2.復(fù)蘇細(xì)胞：將細(xì)胞傳2-3代，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，再傳代，計(jì)數(shù)，大約2000個(gè)/孔鋪板于24孔培養(yǎng)板中

3. 以哺乳動物細(xì)胞篩選為例：

1. 用培養(yǎng)基將G418溶液稀釋為0 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培養(yǎng)基（含有G418的完全培養(yǎng)基），每個(gè)濃度3-4個(gè)重復(fù).

2. .12小時(shí)后換液，將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PBS洗滌一次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)。

確定G418濃度后開始感染細(xì)胞：

3. 將需要感染的細(xì)胞鋪6孔板（20萬/孔），第二天轉(zhuǎn)染，6小時(shí)后換新鮮正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加最佳篩選濃度G418培養(yǎng)基，隔天換液。

4. 換液一兩次后（換液后培養(yǎng)過夜），細(xì)胞達(dá)50%-80%時(shí)，吸出所有培養(yǎng)液，離心3000-4000rpm，棄上清，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，0.22um過濾，混勻4℃?zhèn)溆谩?/span>

5. 培養(yǎng)6天左右細(xì)胞大量死亡時(shí)，可以換用適應(yīng)性培養(yǎng)基，即5中所配制。或者可以增加血清濃度培養(yǎng)，例如原來用10%血清，此時(shí)則可以采用20%血清。

6. .培養(yǎng)10天后將G418濃度減半，維持篩選壓力。

7. 篩選約14天后可見有抗性xx細(xì)胞出現(xiàn)，采用單克隆法或者刮除陰性克隆進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增。

二、嘌呤霉素的篩選步驟：

2.1.預(yù)實(shí)驗(yàn)確定細(xì)胞的最佳適應(yīng)嘌呤霉素的濃度；

1) Day 1：將目的(要進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株改造的細(xì)胞）細(xì)胞種于12或24孔板中；首選鋪板11個(gè)孔；

2) Day2：第2天：靶細(xì)胞應(yīng)該大約80-90%融合;在目標(biāo)細(xì)胞的首選培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素。嘌呤霉素的終濃度應(yīng)為1-10μg/mL，分別為0ug/ml一孔到10ug/ml一孔，每孔的增量為1μg/mL，加入含有等濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基，并做好標(biāo)記；

3) Day3+: 每隔一天換一次新鮮的含嘌呤霉素的培養(yǎng)基；在三到五天后導(dǎo)致完全細(xì)胞死亡的嘌呤霉素的最低濃度是實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用于選擇的濃度，也可以用更精細(xì)的嘌呤霉素增量重復(fù)此滴定，以確定更精確的最佳嘌呤霉素濃度。

2.2細(xì)胞篩選

1）細(xì)胞鋪板，鋪兩個(gè)樣本，正常細(xì)胞株和感染好的細(xì)胞株各鋪一孔，置37度 5%CO2培養(yǎng)

2）待細(xì)胞生長到60%左右的密度，加步驟2.1得出的嘌呤霉素進(jìn)行篩選；

3）每天換液48-72小時(shí)后未感染的正常細(xì)胞株全部死亡，感染的穩(wěn)轉(zhuǎn)株正常生長，得出，穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功.

一鍵直達(dá)：

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