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一看就會:BBB實驗的操作步驟來啦
來源：啟達生物 瀏覽量：1075 發(fā)布時間：2025-03-19
一看就會:BBB實驗的操作步驟來啦
BBB實驗經久不衰，但在實際的操作卻很容易出現(xiàn)滲漏，來看看下面的構建的步驟吧，全干貨分享，點個關注，科研之途不迷路
細胞選擇：HPBC(人腦血管周細胞,啟達生物,貨號： ）HBMEC(人腦血管周細胞,啟達生物，貨號： ）
培養(yǎng)基選擇：PGM（周細胞培養(yǎng)基,啟達生物，貨號： ）ECGM(內皮細胞培養(yǎng)基,啟達生物，貨號： ）
1. 為了讓原代細胞能傳更多的代次，我們可以感染hTERT病毒讓細胞進行永生化改造 ，根據實踐永生化后的細胞可傳40多代，可能SV40病毒更便宜，但是SV40感染后的細胞大部分都需要在33°增殖，而hTERT在37°就能適應。
2. 感染后的細胞需要加入Blasticidin S HCl篩選，為了保持細胞的永生化，感染后需要一直加入終濃度（f.c.）4μg/ml培養(yǎng)，以維持細胞更多倍增。
細胞處理好了 ，現(xiàn)在就開始我們的BBB實驗吧：
1. 準備24孔transwell培養(yǎng)板，準備好ECGM內皮細胞培養(yǎng)基，細胞包被液，在室溫中預熱
2. 在超凈臺中拆開培養(yǎng)板，使用200ul包被液或者稀釋好的膠原酶進行培養(yǎng)前的細胞板包被
3. 包被完成后，使用槍頭將包被液吸出，在每個孔中加入200ul的ECGM內皮細胞培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預熱。
4. 對實驗的細胞，將其從培養(yǎng)箱中取出，吸出培養(yǎng)基，以T75為例用10mL DPBS洗滌，去除DPBS，并加入4 mL 0.05%胰蛋白酶，常溫消化3-5分鐘后顯微鏡下觀察，細胞變得橢圓透亮后輕拍細胞瓶，細胞脫落，立即加入雙倍胰酶的含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，并1000轉5分鐘收集細胞。
5. 用10μL臺盼藍染色制備三個0.5mL的試管，并用細胞名稱標記細胞計數(shù)室載玻片
6. 用移液管從HBMEC或者HPBC細胞懸浮液中吸取10μL，并在0.5mL試管中與10μL臺盼藍染色混合。用移液管將10μL臺盼藍染色的細胞懸浮液移到標記細胞計數(shù)室載玻片的兩側。
7. 將HBMEC和HPBC混合按照1：1混合后（500μL，密度為1.6×105個細胞/mL）接種在細胞培養(yǎng)孔中的半透膜（Transwell插入物）上，形成兩個明確的隔室：頂部或上部隔室，可被視為“血液側”，基底外側或下部隔室，被視為”大腦側“，融合的細胞的單層代表血腦屏障，為了方便后期的檢測，在進行細胞定位分析時，兩種細胞細胞可以與適當?shù)奈镔|混合[例如，CellTracker橙色CMTMR染料（541/565 nm）、紅色熒光染料；
8. 隔天換液，細胞生長4天或達到100%融合，檢測連接復合物形成和受限的滲透性
小細節(jié)多注意：
1. 在孔中抽吸試劑的時候，請不要觸摸微孔
2. 避免在低細胞密度水平下培養(yǎng)（應始終將融合率保持在50%以上）
3. 換液需謹慎，以防止細胞漂浮或細胞特征的喪失
4. 應始終向每種培養(yǎng)基中添加Blasticin S（f.c.4μg/mL），以保持永生化基因的表達。
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1，HBMEC人腦微血管內皮細胞，貨號：CD5177 人腦微血管內皮細胞是血腦屏障的主要組成成分，能夠限制可溶性物質和細胞等從血液進入大腦。大腦微血管內皮細胞與外周內皮細胞相比具有一些相同特性。大腦微血管內皮細胞表面表達細胞粘附分子，調控白細胞進入大腦。由于微血管內皮細胞的器官特異性，內皮細胞通常取源于疾病研究的相關組織。, 2，HPBC人腦血管周細胞，貨號：CD5022 腦瘤患者正常組織提取，黃種成人，經α-SMA免疫熒光染色，腦血管周細胞分布于腦組織的微血管系統(tǒng)中，調節(jié)血管形成、穩(wěn)定和功能的關鍵因素。周細胞P3代提供，使用周細胞培養(yǎng)基（啟達貨號:P4001）細胞可達10倍增。 3，ECGM內皮細胞培養(yǎng)基，貨號：P1001 內皮細胞培養(yǎng)基經10種人各部位的內皮細胞的測試和優(yōu)化，經無菌，無支原體，無內毒素檢測，添加肝素，內皮生長因子，胰島素，抗氧化劑，皮質醇等組分。內皮細胞培養(yǎng)基是一種低血清內皮細胞完全培養(yǎng)基，適合血管內皮細胞和永生化的內皮細胞株。, 4，PGM周細胞培養(yǎng)基，貨號：P4001 周細胞經常與血管平滑肌細胞(vSMC)，成纖維細胞，巨噬細胞，甚至上皮細胞的混淆，研究表明，MB因子可促進周細胞的生長， B27和N2可維持細胞的基本特征，所以本培養(yǎng)基除了基礎和血清外，還添加了MB,B27,N2等生長因子，以滿足細胞生長需求。, 5，AGM星形膠質細胞培養(yǎng)基，貨號：P2701 星形膠質細胞培養(yǎng)基是專門正常原代星形膠質細胞體外培養(yǎng)設計的最適于其生長的培養(yǎng)基，血清含量2%，此培養(yǎng)基含有星形膠質細胞生長所需要的TGF，PDGF等生長因子，并添加抑制神經細胞生長的激素，適合大部分星形膠質細胞的生長。
