1.小鼠處死與取材：

將小鼠用頸椎脫臼法或過量麻醉劑（如戊巴比妥鈉，劑量為50-100mg/kg體重）處死，迅速將其仰臥固定于解剖板上。

用75%酒精消毒腹部皮膚，沿腹部正中線剪開皮膚和腹壁，暴露胸腔。

用眼科剪小心剪開胸腔，充分暴露心臟和肺臟。

用注射器經(jīng)右心室向肺動(dòng)脈內(nèi)注入約5ml無菌PBS，直至肺臟變白，以沖洗掉肺內(nèi)的血液。

用眼科剪小心剪下肺臟，放入盛有預(yù)冷無菌PBS的培養(yǎng)皿中，輕輕漂洗2-3次，去除表面的血跡和雜質(zhì)。

2.組織剪碎與消化：

將漂洗后的肺臟轉(zhuǎn)移至新的無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將肺組織剪成約1mm3的小塊。

將剪碎的肺組織塊轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的膠原酶Ⅱ溶液（每克肺組織約加入5-10ml），輕輕混勻。

將離心管用封口膜密封好置于37℃水浴中消化30-60min，期間每隔5-10min輕輕振蕩一次，使消化充分。

3.細(xì)胞懸液制備：

消化結(jié)束后，將離心管取出，800-1000r/min離心5 - 10min，棄去上清液。

向沉淀中加入適量的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫靜置5-10min，以裂解紅細(xì)胞。

再次800-1000r/min離心5min，棄去上清液。

用適量的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸沉淀，然后依次通過70μm和40μm的細(xì)胞篩，去除較大的組織碎片，得到單細(xì)胞懸液。

4.細(xì)胞接種與培養(yǎng)：

將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800-1000r/min離心5 min，棄去上清液。

用適量的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度至（1 -2）×10^6cells/ml。

將細(xì)胞懸液接種于預(yù)先包被有明膠或纖連蛋白的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)12小時(shí)后，輕輕倒掉培養(yǎng)液，用無菌PBS輕輕漂洗2-3次，去除未貼壁的細(xì)胞，然后加入新鮮的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.細(xì)胞觀察：
在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)，記錄細(xì)胞的貼壁情況、生長(zhǎng)速度、形態(tài)變化等。正常的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈鋪路石樣外觀。

2.細(xì)胞鑒定：
培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞鑒定。常用的鑒定方法包括免疫熒光染色檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物（如CD31、vWF等）、攝取乙?；?/span>低密度脂蛋白（Ac - LDL）等。

以上步驟僅為一般的小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取方法，實(shí)際操作中可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

推薦產(chǎn)品：
1. ECGM-M小鼠內(nèi)皮培養(yǎng)基（貨號(hào)：P1001-M）

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基經(jīng)10種人各部位的內(nèi)皮細(xì)胞的測(cè)試和優(yōu)化，經(jīng)無菌，無支原體，無內(nèi)毒素檢測(cè)，添加肝素，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，胰島素，抗氧化劑，皮質(zhì)醇等組分，為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的正常的新陳代謝過程，培養(yǎng)基盡量減少生長(zhǎng)刺激的因子組分。
適用除人源外哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2. 免程序降溫細(xì)胞凍存液（低血清）（貨號(hào)：SD0001）

讓細(xì)胞凍存更加方便：

1.它無需程序降溫，細(xì)胞凍存后直接放入-80°過夜，24小時(shí)移入液氮即可。

2.它含有2%的血清，含有抗氧化劑和細(xì)胞休眠時(shí)所細(xì)胞的蛋白質(zhì)和氨基酸。

3.它只含有5%DMSO,因?yàn)镈MSO一旦濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在凍存時(shí)中毒，復(fù)蘇細(xì)胞存活少，或者長(zhǎng)時(shí)間不長(zhǎng)。