問：LUC標(biāo)記細(xì)胞小動(dòng)物成瘤后檢測(cè)底物需要注射到腫瘤部位嗎?

答：在活體生物發(fā)光成像（BLI）中，D-熒光素（luciferin）經(jīng)腹腔（IP）或皮下（SC）注射后即可通過血液循環(huán)到達(dá)全身各處，與已表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞反應(yīng)，因此無需直接注射到腫瘤局部即可實(shí)現(xiàn)成像.

問：小動(dòng)物成瘤后檢測(cè)不到 LUC 熒光怎么辦？

常見原因可按“表達(dá)-遞送-反應(yīng)-采集”四步排查,具體如下， 收藏起來，LUC標(biāo)記的小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)輕松過關(guān)！

(一）表達(dá)環(huán)節(jié)

1. 熒光素酶（Luc）表達(dá)丟失：體外篩到的“陽性”克隆在體內(nèi)傳代或凍存后發(fā)生啟動(dòng)子甲基化、質(zhì)粒丟失，導(dǎo)致實(shí)際表達(dá)量低于儀器檢測(cè)限。

2. 免疫清除：在免疫健全小鼠中，Luc 作為外源蛋白可被 CD8? T 細(xì)胞識(shí)別并殺傷高表達(dá)細(xì)胞，造成信號(hào)進(jìn)行性下降甚至消失。

3. 啟動(dòng)子沉默：CMV 等病毒啟動(dòng)子易受 IFN-γ 等細(xì)胞因子影響而下調(diào)，尤其在炎癥或壞

死區(qū)域

（二）底物遞送環(huán)節(jié)

1. 底物量不足：腹腔注射劑量一般按 150 mg/kg 計(jì)算，若稱重或稀釋有誤，或動(dòng)物麻醉過深導(dǎo)致循環(huán)衰竭，底物難以到達(dá)腫瘤。

2. 給藥途徑不當(dāng)：皮下/尾靜脈注射時(shí)漏液，或腫瘤血供差（中心大面積壞死），局部底物濃度低于 Km 值。

3. 底物失效：D-熒光素反復(fù)凍融、室溫放置 >2 h 會(huì)降解；粉末受潮也會(huì)失活。

 
(三）反應(yīng)環(huán)境環(huán)節(jié)

1. 缺氧：腫瘤>8 mm 時(shí)中心常嚴(yán)重缺血缺氧，熒光素酶反應(yīng)需 O? 和 ATP，缺氧區(qū)信號(hào)會(huì)顯著減弱。

2. pH 過低：壞死核心區(qū) pH<6.5 會(huì)抑制酶活。

3. 底物競爭/抑制：血中高濃度脂肪酸、抗生素（如四環(huán)素）或動(dòng)物同時(shí)給予其他熒光試劑，可產(chǎn)生抑制或吸收。

(四）信號(hào)采集環(huán)節(jié)

1. 儀器參數(shù)設(shè)置：曝光時(shí)間過短（<1 s）、binning 值過低、光圈未全開都會(huì)漏掉弱信號(hào)；背景扣除閾值設(shè)得過高也會(huì)把真實(shí)信號(hào)“歸零”。

2. 毛發(fā)/位置干擾：黑毛或金屬耳標(biāo)對(duì) 560 nm 光子吸收強(qiáng)；深部臟器（胰腺、顱內(nèi)）未用 37 °C 預(yù)熱臺(tái)，也造成信號(hào)衰減。

3. 采集窗口錯(cuò)過：峰值一般在底物注射后 10–15 min（小鼠），若延遲到 30 min 以后，信號(hào)已下降 80% 以上。

LUC檢測(cè)不到怎么辦？
① 體外再測(cè)一次細(xì)胞 Luc 活性（加底物立即發(fā)光可排除表達(dá)問題）；
② 同批底物在已知陽性瘤小鼠上測(cè)試，可排除底物/儀器因素；
③ 取瘤體做 IHC 或 Western 確認(rèn) Luc 蛋白是否仍在；
④ 若懷疑免疫清除，可改用 Nude/NSG 小鼠或短暫免疫抑制（環(huán)孢素 3 d）再挑戰(zhàn)。