養(yǎng)了細胞后就會發(fā)現(xiàn)，即使是一瓶細胞，但是每個細胞的分裂時間卻不一致，有些已經(jīng)分裂生長完成了，有些細胞還在分裂初始，但是在大部分實驗中，都需要細胞保持生長周期同步化，才能讓實驗數(shù)據(jù)更為精確。因此，只能進行人工干預啦。

1.有絲分裂搖脫法（Mitotic Shake-off）

原理：M期細胞變圓、貼附力下降，通過輕輕搖晃或拍擊培養(yǎng)瓶可使M期細胞脫落

操作流程：

1. 對數(shù)生長期細胞（密度5-8×10?/mL）

2. 加入諾考達唑 40-100 ng/mL

3. 培養(yǎng)10-14 h

4. 離心收集（300×g，5 min）

5. 冷PBS（4℃）洗滌2次

【關鍵步驟：低溫促進微管解聚，增強M期阻滯】

6. 37℃溫培養(yǎng)基洗滌1次

7. 重懸于新鮮完全培養(yǎng)基，37℃孵育

8. 每隔15-30 min取樣，流式檢測pHH3（M期標志）

9. 當M期細胞>80%時，即為同步化M期細胞

2. G0期誘導（血清饑餓法）

原理：剝奪生長因子使細胞退出周期進入G0期

1、取處于對數(shù)生長期的細胞；

2、用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，注：有時候完全去掉細胞發(fā)生死亡，因此可以嘗試用含1%-2%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24-48h；

3、用胰蛋白酶消化細胞即可收獲G0期細胞

3. 雙胸苷阻斷法（Thymidine Double Block） — 最常用

Day 0: 接種細胞（30-40%密度）

Day 1: 第1次胸苷阻斷（2 mM，16 h）

        ↓  PBS洗3次，換新鮮培養(yǎng)基

Day 2: 釋放培養(yǎng)（9 h）

        ↓

       第2次胸苷阻斷（2 mM，16 h）

        ↓  PBS洗3次

Day 3: 獲得同步化細胞（此時為G1/S邊界）

        可每隔2 h取樣追蹤周期進程

懸浮細胞需重點關注以下哦:

一、細胞洗滌：

1. 細胞懸液轉移至離心管

2. 室溫或37℃，300×g，5 min離心

3. 棄上清，輕彈管底分散細胞團

4. 加入37℃預溫培養(yǎng)基/PBS，輕柔吹打重懸

5. 重復2-3次

二、防成團技巧：

- 使用硅化離心管

- 加入0.1-0.5 mM EDTA（不影響大多數(shù)細胞）

- 使用寬口吸頭，減少機械剪切