屏障功能檢測(cè)不可缺少的TEER操作SOP

TEER（Trans-Epithelial/Endothelial Electrical Resistance，跨上皮/內(nèi)皮電阻）實(shí)驗(yàn)是評(píng)估細(xì)胞單層屏障完整性、緊密連接形成及離子通透性的標(biāo)準(zhǔn)方法，廣泛應(yīng)用于血腦屏障(BBB實(shí)驗(yàn)）、腸道屏障、呼吸道上皮等模型。其操作原理是通過歐姆定律來檢測(cè)細(xì)胞形成的屏障的完整性，電阻值越高，表明細(xì)胞間緊密連接越完整，屏障功能越強(qiáng)

TEER實(shí)驗(yàn)操作流程來啦

一、儀器準(zhǔn)備：

上皮/內(nèi)皮電壓歐姆計(jì)：如 EVOM2/EVOM3（World Precision Instruments）、Millicell ERS 3.0 等

電極：

筷子電極（Chopstick electrodes）：手持式，適合快速篩查

腔室電極（EndOhm chamber）：測(cè)量更穩(wěn)定、可重復(fù)性更高

Transwell 小室：常用 6.5 mm（膜面積 0.33 cm2）或 12 mm 規(guī)格，孔徑 0.4 μm（需根據(jù)細(xì)胞類型選擇）

無菌鑷子

二、試劑準(zhǔn)備

完全培養(yǎng)基（根據(jù)細(xì)胞類型配制）

無 Ca2?/Mg2? 的 PBS（用于電極清洗）

膠原/基質(zhì)膠/細(xì)胞包被液（用于貼壁不牢的細(xì)胞株及原代細(xì)胞）

三、小室初養(yǎng)成

1. 不同的細(xì)胞鋪板的密度不一樣，生長很慢的細(xì)胞和鋪板貼壁不牢的細(xì)胞需要提高鋪板密度 ，正常的細(xì)胞接種密度在1*10^5cells/ml左右即可。

2. 下室提前加入 1–1.5 mL 無細(xì)胞的完全培養(yǎng)基后再取1ml細(xì)胞懸液種于Transwell 小室上室；置于37°C、5% CO? 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

3. 待細(xì)胞形成緊密連接后，每1天測(cè)量一次直到電阻指數(shù)進(jìn)入平臺(tái)期

測(cè)量步驟：

·  將 Transwell 小室用無菌鑷子轉(zhuǎn)移至 EndOhm 腔室中

·  確保上下室液體體積一致，消除液面高度差引起的誤差

·  按照儀器說明書測(cè)量電阻值

四、計(jì)算 TEER 值（單位面積電阻）

由于電阻與膜面積成反比，需將組織電阻乘以有效膜面積，標(biāo)準(zhǔn)化為 Ω·cm2：TEER=(Rtotal?Rblank)×A

其中：

A = Transwell 膜的有效面積（cm2）

比如：6.5 mm Corning Transwell：A=0.33 cm2

12 mm Transwell：A=1.12 cm2

五、部分細(xì)胞屏障形成時(shí)間

原代細(xì)胞（如原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞）：屏障形成更完整，但培養(yǎng)周期長（10–14 天或更長）若和周細(xì)胞共培養(yǎng)，一般5-10天即可形成完整屏障

永生化細(xì)胞系（如 bEnd.3、hCMEC/D3）：增殖快，通常 5–7 天 即可形成可檢測(cè)屏障

iPSC 分化細(xì)胞：分化成熟需 10–21 天

Caco-2：≥300–500 Ω·cm2（通常需培養(yǎng)20天以上）

呼吸道上皮：>500 Ω·cm2，至少持續(xù)培養(yǎng) 12-15天

六、細(xì)節(jié)注意，一次成功：

溫度需要控制好：溫度每變化 1°C，電阻值可變化約 2–3%。建議所有樣品在相同溫度下測(cè)量，或進(jìn)行溫度校正

液體體積要平均：每次測(cè)量時(shí)上下室液體體積必須嚴(yán)格一致，液面高度差會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)誤差；

電極位置要打底： 長電極必須觸及培養(yǎng)板底部；短電極在上室。電極不可接觸膜表面，避免刺破細(xì)胞層。

測(cè)量時(shí)機(jī)要選對(duì)： 避免在換液后立即測(cè)量，建議等待 30 分鐘至 1 小時(shí)，使細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。

細(xì)胞匯合度要均勻： 接種時(shí)確保細(xì)胞均勻分布；若生長不均勻，會(huì)導(dǎo)致 TEER 值偏低且不穩(wěn)定。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板時(shí)需避免晃動(dòng)。

電極維護(hù)要及時(shí)： 測(cè)量前后用 PBS 沖洗電極，避免鹽結(jié)晶堵塞。定期用乙醇消毒

報(bào)告要用MIRTA 規(guī)范 ：發(fā)表時(shí)需報(bào)告設(shè)備型號(hào)、電極類型、校準(zhǔn)方法、膜面積、培養(yǎng)基成分及測(cè)量溫度等