小鼠胚胎MEF細(xì)胞的提取步驟：

1.將新鮮收獲的胚胎放入10厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中

2.用PBSA覆蓋胚胎，取出胎盤(pán)和其他母體組織

3.切掉頭頂（眼睛及以上），取出內(nèi)臟

4.保存頭部/卵黃囊進(jìn)行DNA分離以進(jìn)行基因分型檢測(cè)

5.將胚胎體置于單獨(dú)的10厘米板中

6.加入1mL胰蛋白酶，用刀片切碎成1mm的小碎片

7.用酒精燈火焰對(duì)樣品之間的刀片進(jìn)行消毒

8.將皿置于37°C培養(yǎng)箱中30-45分鐘（傾斜，使胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞）

9.通過(guò)在每口井中添加4mL MEF培養(yǎng)基（通常DMEM+10%FBS+1%G/A）來(lái)抑制typsin活性。

10.用移液管10-20x吹打分離組織

11將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到T75燒瓶或10cm平板上，并添加6-15mL MEF培養(yǎng)基

12.讓細(xì)胞生長(zhǎng)融合（3-4天）

13.抽出培養(yǎng)基，用10mL PBS沖洗

14.加入3mL胰蛋白酶，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10min

15.加入7mL MEF培養(yǎng)基進(jìn)行中和

16.用移液管吸至離心管離心，使細(xì)胞重新懸浮

17.將懸浮液轉(zhuǎn)移到2個(gè)T175燒瓶中，并向每個(gè)培養(yǎng)瓶中添加50mL MEF培養(yǎng)基

18.讓細(xì)胞生長(zhǎng)融合（3-4天）

19通過(guò)胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，冷凍細(xì)胞@3x106細(xì)胞/瓶，注意冷凍不能密度太稀，此細(xì)胞凍存后復(fù)蘇的存活會(huì)大量減少。

備注：1.在細(xì)胞培養(yǎng)房中執(zhí)行細(xì)胞分離，并注意無(wú)菌操作，

2. 建議使用含有血清的凍存液凍存，比如我們的低血清免程序凍存液，啟達(dá)貨號(hào)：(SD0001）

3. 原代分離培養(yǎng)請(qǐng)使用慶大霉素/兩性霉素溶液來(lái)防止細(xì)胞污染發(fā)生，啟達(dá)生物貨號(hào)：SD0038，P/S中的青霉素在培養(yǎng)基中使用含量在60ug/ml以上，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞后期產(chǎn)生抗生素耐藥，從而影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

MEF滅活處理/絲裂霉素C處理：

常用于IPS有滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)采用經(jīng)過(guò)輻射滅菌或絲裂霉素C 處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEF) 滋養(yǎng)層，使細(xì)胞周期停滯； 這種“滅活”可防止MEF過(guò)快生長(zhǎng)并與生長(zhǎng)較慢的PSC進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。

1. 取新的培養(yǎng)瓶，加0.1％Gelatin溶液覆蓋預(yù)處理30分鐘，用前吸掉Gelatin溶液。

2. 取需要處理的MEF細(xì)胞，以10ug/ml濃度加絲裂霉素（Mitomycin C）混勻。

3. 置培養(yǎng)箱中3小時(shí)。

4. 吸棄廢液。

5. 用DPBS洗5遍，以完全去除絲裂霉素C。

6. 處理過(guò)的MEF加適量培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，以3.0×104/ cm²（MEF）鋪在Gelatin處理過(guò)的培養(yǎng)瓶上

7. 置培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜，使其貼壁

8. 鋪好的飼養(yǎng)層在1-7天內(nèi)有效，都可以支持mES生長(zhǎng)并維持其全能性。