一、材料準備

　　可拍照顯微鏡,Transwell小室,孔徑8μm,沒包被膠的Transwell,遷移實驗的細胞培養(yǎng)板24孔板。細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,無血清的基礎培養(yǎng)基，正常的完全培養(yǎng)基,無菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結晶紫染液(0.1%PBS結晶紫)

　　二、步驟和流程

　　1.用BD公司的Matrigel 1:8或者根據(jù)細胞產生mmp的量來決定稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。

　　2.制備細胞懸液前可先用只加1%血清的完全培養(yǎng)基讓細胞饑餓12-24h,進一步去除血清的影響。

　　3.消化細胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的無血清培養(yǎng)基重懸及調整密度，通常調整細胞密度至5×10^5cells/ml。

4. 取細胞懸液100μl加入Transwell上室,　也可以根據(jù)細胞生長速度進行調整，操作小提示：接種劑量不同的細胞，其侵襲能力是不同的，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，最后會難以統(tǒng)計結果;而細胞量過少，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，進入下室。因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。

5. 24孔板下室一般加入600μl含生長因子或血清的完全培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產生,一旦產生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就會減弱甚至消失,種板時一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起去除完氣泡,再將小室放進培養(yǎng)板。若是平行孔，一般設置兩組。

　　6.培養(yǎng)細胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依細胞侵襲能力而定)。24h較常見,時間節(jié)點的設置除了要考慮到細胞的侵襲力外,處理因素以及細胞數(shù)目的影響也不可忽視。

三、結果統(tǒng)計步驟：

1. 采用直接計數(shù)法,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當風干。

　　2. 0.1%結晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,注意不要蹭到已穿膜的那一層細胞，之后再用PBS洗3遍。

3. 400倍顯微鏡下每個樣本取6-10個視野觀察細胞計數(shù)，取平均值，統(tǒng)計分析