組織培養(yǎng)類器官分離：

添加含有雙抗、慶大霉素的類器官緩沖液浸泡，用眼科鑷刮去組織血液，粘膜，腸絨毛等。在培養(yǎng)皿中用類器官緩沖液清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1mm3的組織塊

1.為了促進 BME 的去除，將組織置入15ml離心管，加入 10 mL 冰預(yù)冷的 DMEM/F12培養(yǎng)基，在 4°C 條件下以 200 g 的轉(zhuǎn)速離心 5 分鐘。

2.吸出上清液，采用 TrypLE 或機械破碎來分解類器官，前者適用于頭頸部和緊實的乳腺、結(jié)腸、胰腺和肝臟類器官，后者適用于卵巢和囊性的乳腺、結(jié)腸、胰腺和肝臟類器官。

機械破碎法：

將沉淀重懸在 3 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基中。在移液器上裝上 P1000 帶濾芯吸頭和（不帶濾芯）P10 吸頭，上下吹打類器官懸液 30 -50次。槍頭緊靠管的底部來產(chǎn)生更大壓力，有助于類器官的分解。

TrypLE消化法：

1. 將沉淀重懸在 3-5 mL TrypLE 中，上下吹打并在 37°C 條件下孵育，直至類器官分解。在移液器上裝上 P1000 帶濾芯吸頭和（不帶濾芯）P10 吸頭，每 3～5 分鐘上下吹打 ≥ 10 次，以促進類器官的分解。密切監(jiān)控消化過程，盡量縮短 TrypLE 的孵育時間，不同類型或者量的組織，消化時間不同，消化時間不宜過長。例如穿刺樣本為 10 min，小的組織碎片團為 30 min～1 h。

2. 使用 P1000 移液器上下吹打 10～20 次，進一步促進組織破碎。從頂部加入10ml含有10%KOSR-SerumReplacer?的D/F培養(yǎng)基，并在 4℃ 下以 200 g 離心 5 分鐘，對細胞進行清洗。

3. 將沉淀重懸在 含有10%KOSR-SerumReplacer? 10 mL培養(yǎng)基中，并用 70～100 μm 細胞濾網(wǎng)進行過濾。

4. 對重懸和過濾后的細胞進行離心，在 4°C 下以 200 g 離心 5 分鐘

注意的小細節(jié)：

如果過篩后的細胞沉淀呈紅色，可能有血紅細胞污染，建議加入 5 mL 紅細胞裂解液 4°C 處理 5 分鐘。完成裂解后，在 15 mL 管中加滿 PBS 清洗一次，然后在 4°C 下 500 g 離心 3 分鐘。

類器官培養(yǎng)：

將消化好的細胞懸液計數(shù)，按照1-2萬細胞每孔計算所需的細胞數(shù)，根據(jù)計算好的體積吸取細胞懸液加入預(yù)冷的1.5 mL離心管中，補齊預(yù)冷的培養(yǎng)基至所需體積，將預(yù)冷后的細胞懸液加入等體積的Matrigel基質(zhì)膠中輕輕混勻(全程冰上操作)，然后將細胞與基質(zhì)膠的混合液按照40 μL/孔（不低于10,000 個細胞/40ul)接種于24孔板。將接種好的培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱至少30 min，待Matrigel完全凝固，然后沿24孔壁每孔緩慢加入500 μL預(yù)先恢復(fù)至室溫的類器官培養(yǎng)基，3天后鏡下觀察類器官形成情況，粒徑大于50 μm即認為類器官已經(jīng)形成，每5天更換一次培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，持續(xù)觀察類器官大小，鏡下觀察大部分類器官大小均大于50 μm且大小不再增大即可收集類器官進行后續(xù)實驗。

3. 類器官傳代

待器官形成并且不再增殖后，收集類器官，

1. 加入組織消化液37°消化10-15min。

2. 使用KOSR-SerumReplacer?血清替代物或者0.2%的BSA溶液終止消化

3. 使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進行過濾

4. 1500 rpm離心3 min，棄上清，使用HBSS重懸沉淀后1500 rpm再次離心3 min；加入預(yù)冷的類器官培養(yǎng)基進行重懸，計數(shù)，按照培養(yǎng)步驟操作繼續(xù)培養(yǎng)。

類器官凍存：采用啟達生物組織/類器官凍存液直接凍存（貨號：SD0055）凍存后需程序降溫，第二天移入液氮。