A. 溶液與試劑

注：利用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級(jí)別的水制備溶液。

準(zhǔn)備好1X磷酸鹽緩沖液 (PBS),1X Tris鹽緩沖液（TBS）,1X SDS樣品緩沖液：

通過添加1/10體積的30XDTT至1體積的3XSDS上樣緩沖液，制備新鮮的3X還原上樣緩沖液。用dH2O稀釋至1X。

10X Tris-GlycineSDS電泳緩沖液：要制備1L1X

電泳緩沖液：向900mldH2O中添加100ml 10X電泳緩沖液，然后混勻。

10X Tris-Glycine 轉(zhuǎn)移緩沖液：要制備1L1X轉(zhuǎn)移緩沖液，向200ml甲醇+700ml dH2O中添加100ml10X轉(zhuǎn)移緩沖液，然后混勻。

含 Tween20的 10X Tris鹽緩沖液(TBST-10X)：要制備1L 1XTBST：向900mldH2O中添加100ml 10X TBST，然后混勻。

脫脂奶粉：

封閉緩沖液：含5%w/v 脫脂奶粉的1XTBS；要制備150 ml，向150ml 1X TBS中添加7.5g脫脂奶粉并充分混勻。Tween20不應(yīng)添加至封閉緩沖液中，因?yàn)樗哂凶园l(fā)熒光并且能夠增加非特異性背景。在封閉步驟之后，隨后的稀釋劑緩沖液中再添加Tween20。

洗滌緩沖液：1XTBST。

牛血清白蛋白 (BSA)

一抗稀釋緩沖液：如一抗數(shù)據(jù)表上所示，含5%BSA或5%脫脂奶粉的1X TBST；要制備20ml，向20ml 1X TBST中添加1.0gBSA或脫脂奶粉并充分混勻。

二抗稀釋緩沖液：含5%脫脂奶粉的1XTBST；要制備20ml，向20ml 1X TBST中添加1.0g脫脂奶粉并充分混勻。（二抗選擇；抗兔或抗小鼠）。

預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，寬范圍(11-190kDa)：。

印跡膜和紙：硝酸纖維素膜，通常推薦0.2 μm孔徑。

B. 蛋白質(zhì)印跡

制備樣品的常規(guī)流程。

1.添加含有調(diào)節(jié)因子的新鮮培養(yǎng)基，使其對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理一段時(shí)間。

2.從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基；使用冷的1XPBS 洗滌細(xì)胞；吸取。

3.加入1X SDS樣品緩沖液（6孔板每孔100μl或10cm直徑的平板每平板500μl）來裂解細(xì)胞。立即從板上刮下細(xì)胞并將提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管。置于冰上。

超聲處理10–15秒以完成細(xì)胞裂解并剪切DNA（以降低樣品粘度）。

4.取20μl樣品，在95–100°C下加熱5分鐘；放在冰上冷卻。

5.微量離心機(jī)內(nèi)離心5分鐘。

6.上樣20μl到SDS-PAGE凝膠 (10cm x 10cm) 上。

注：建議將預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（10μl/泳道）上樣以驗(yàn)證電轉(zhuǎn)移和確定分子量。預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品在近紅外波長范圍內(nèi)具有自發(fā)熒光。

7.電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。

C.膜封閉和抗體孵育

注：容量適用于 10cm x 10cm (100cm2)的膜；對(duì)于不同尺寸的膜，請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整容量，轉(zhuǎn)移之后，在室溫下用25mlTBS將硝酸纖維素膜洗滌5分鐘。

將膜置于25ml封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

關(guān)鍵步驟：切勿在封閉緩沖液中加入 Tween 20。

8.用15mlTBST洗滌三次，每次5分鐘。

9.將膜和一抗（稀釋到相對(duì)的濃度）置于10ml一抗稀釋緩沖液中在4°C下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

用15mlTBST洗滌三次，每次5分鐘。

將膜與熒光素偶聯(lián)的二抗（稀釋度為 1:5000-1:25,000的1mg/ml原液）在室溫下于10ml 二抗稀釋緩沖液中孵育1小時(shí)，并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

用15mlTBST洗滌三次，每次5分鐘。

D. 蛋白質(zhì)檢測

將膜上多余的TBST瀝干，可使其干燥。

關(guān)鍵步驟：對(duì)于熒光染色，必須確保膜干燥。

請(qǐng)使用合適的熒光掃描儀掃描膜。