腫瘤干細胞是是一群既具有自我更新能力又具有較強的侵襲遷移的細胞，對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發(fā)有著重要作用。腫瘤細胞的成球實驗（成球大小及數(shù)目）是衡量腫瘤細胞干性的金標準。

腫瘤干細胞成球實驗一般將分選干細胞放在無血清培養(yǎng)基、超低粘附培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，但也可以細胞系做。惡性程度高的細胞系是很容易成球的，但有的細胞系很困難，所以一般建議用腫瘤干細胞培養(yǎng)，細胞容易成球。

（1）一般選擇多大的培養(yǎng)皿，6孔板？

培養(yǎng)皿可以選擇6，12，24孔板，也可以選擇100 mm培養(yǎng)皿；

（2）接種密度？10000~100000個/ml還是說這個都要靠自己去摸索？有沒參考密度？

密度需要自己摸索。低密度常用于原代腫瘤干細胞的提取，篩選可以非粘附生長的細胞。高密度用于細胞球的擴增，一般來說5000個/ml以上的細胞量成球比較好。

（3）怎么換液？

一周加兩次完全培養(yǎng)基。以6孔板為例，每次加入500ul，加入后輕輕搖勻，細胞球生長很緩慢，培養(yǎng)基中的生長因子至少能夠支持2周以上。直接加入腫瘤干細胞無血清完全培養(yǎng)基，不推薦直接添加的細胞生長因子，確實會影響成球質量。

一旦成球后需要消化傳代，細胞球傳代需要用弱的消化酶，可使用的是TrypLE Express。據(jù)說Accutase和Dispase也可以。消化步驟如下：

• 70μm的細胞篩過濾收集細胞球，TrypLE Express消化。

• 2%BSA溶液終止消化，PBS清洗細胞2次。

• 重懸細胞，計數(shù)。

• 用超低吸附的細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞（6孔板中每孔加入大約1000個細胞）。

• 培養(yǎng)大約10-14天，觀察細胞成球情況并計算SPF。

成球能力是腫瘤干細胞體外鑒定的一個重要方法。其判斷的是單個細胞在合適的條件培養(yǎng)基中自我更新的能力，一般用細胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）表示。

腫瘤球凍存：

1.將離心機調到2000RMP的轉速，置入需要離心的球體或者類器官，啟動離心機，待轉速達到2000后，按下停止鍵，離心機完全停止后取出離心管，再操做第二步驟）

2.把腫瘤球體吸入離心管中，加入凍存液，凍存類器官或者腫瘤球體請按照凍存細胞的濃度凍存

3.吹勻并置于準備好的凍存管中，請注意此凍存液需要使用程序降溫盒降溫（置于-20°12個小時后再放入-80°24個小時方可轉入液氮）。