走上人跡罕至的道路，產(chǎn)生一個(gè)敲除細(xì)胞系而不是敲除細(xì)胞？我們?cè)谶@篇文章中為您介紹了利用同源定向修復(fù)途徑、設(shè)計(jì)最佳供體DNA以及避免此類基因組編輯中常見事故的技巧和竅門。

敲入突變和基因編輯

靶向基因組編輯事件分為兩大類：敲除和敲除。敲除的目的是通過(guò)產(chǎn)生移碼突變來(lái)破壞DNA翻譯。大多數(shù)細(xì)胞修復(fù)事件都會(huì)產(chǎn)生這些類型的突變，使其成為一項(xiàng)“簡(jiǎn)單”的編輯工作。然而，對(duì)于敲門磚來(lái)說(shuō)，情況并非如此。敲入突變通常需要在精確的基因組位置結(jié)合精確的DNA序列，幾乎沒(méi)有錯(cuò)誤的余地。毫不奇怪，這些編輯比淘汰對(duì)手需要更多的計(jì)劃和技巧。

要開始一個(gè)敲門實(shí)驗(yàn)，首先要問(wèn)的問(wèn)題是從哪里敲除，所以需要確定你想在基因組中引入你的敲門磚的位置。然后再選擇使用哪種Cas酶，并設(shè)計(jì)一個(gè)gRNA到你想引入編輯的地方。最后，你必須知道引入什么序列，這是通過(guò)設(shè)計(jì)和使用供體DNA分子來(lái)完成的。你的供體分子需要與新序列兩側(cè)的靶基因座具有同源性。這種同源性將引導(dǎo)細(xì)胞使用供體DNA作為修復(fù)的模板，這樣才會(huì)讓你的序列的結(jié)合，最后敲除成功！那么，捐贈(zèng)者是如何被用作修復(fù)的模板的呢？請(qǐng)看以下分解。

同源性定向修復(fù)與基因組工程

制造敲除細(xì)胞系的最簡(jiǎn)單方法是利用細(xì)胞已經(jīng)具有的內(nèi)置修復(fù)途徑來(lái)修復(fù)DNA雙鏈斷裂——（HR）。

HR是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中占主導(dǎo)地位的同源定向修復(fù)（HDR）途徑，但通常是一種不太常見的DNA修復(fù)機(jī)制。平均而言，它只占DNA修復(fù)不到10%，不同細(xì)胞類型的修復(fù)率各不相同。差異可能是由細(xì)胞周期速率引起的；快速生長(zhǎng)的細(xì)胞將比緩慢的細(xì)胞具有更高的HR頻率。重要的是要知道HR經(jīng)常在癌癥細(xì)胞中發(fā)生突變，特別是在實(shí)驗(yàn)室常用的乳腺和卵巢細(xì)胞系中。建議您在嘗試HDR敲除之前檢查細(xì)胞系中HR相關(guān)的突變。

圖1：通過(guò)同源重組修復(fù)DNA雙鏈斷裂的早期步驟。

設(shè)計(jì)HDR

HDR途徑的基礎(chǔ)依賴于模板分子的修復(fù)，模板分子通常是內(nèi)源性可用的姐妹染色單體，盡管也可以使用外源DNA。以下是為成功的HDR活動(dòng)設(shè)計(jì)供體DNA的一些考慮因素。

CRISPR切割位置

將CRISPR切割部位盡可能靠近敲入位置。HDR依賴于在斷裂部位切除形成ssDNA，并利用ssDNA的末端找到修復(fù)模板。當(dāng)插入物在斷裂的10bps以內(nèi)時(shí)，觀察到最高的HDR效率，使切割基本上作為模板DNA的一部分。

同源序列和樣本類型

為了確保你的供體分子被用作模板，你需要在敲入位點(diǎn)的右邊和/或左邊加入同源序列。該序列的長(zhǎng)度和組成（單股與雙股）都取決于載體的大小。同源序列至40bps的單鏈寡核苷酸供體（ssODN）可以有效地敲入幾百bps的序列。然而，如果你有一個(gè)更大的敲除（200 bp–2 kb），由于寡核苷酸的合成限制，將需要使用dsDNA供體。這些載體傳統(tǒng)上在500bp至1kb范圍內(nèi)具有較大的同源序列，然而，最近也有使用了較短的同源區(qū)并取得了一些成功（Yu等人，Nat Chem Biol）。

突變PAM或sgRNA序列

Cas9可能在靶位點(diǎn)經(jīng)歷多輪切割，直到PAM位點(diǎn)或引導(dǎo)物識(shí)別序列的一部分通過(guò)突變被破壞。通過(guò)在供體DNA的PAM或引導(dǎo)識(shí)別序列中引入突變，可以保證HDR后不會(huì)再靶向。如果你的Cas9切入了一個(gè)基因的編碼區(qū)，請(qǐng)確保你引入的PAM編輯是一個(gè)沉默的突變，這樣你就不會(huì)意外地改變你感興趣的蛋白質(zhì)。

圖2：停止PAM的再切割并引導(dǎo)供體DNA中RNA破壞突變

將HDR提升到其他編輯之上

HDR并不是DNA修復(fù)最常見的編輯途徑。在HDR編輯時(shí)要傾斜刻度，您可以嘗試以下一個(gè)或多個(gè)不同的編輯位置。

其他修復(fù)機(jī)制

除了HR之外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞還有兩種主要的修復(fù)機(jī)制——非同源末端連接（NHEJ）和替代末端連接（alt-EJ）。對(duì)這兩種途徑的重要成分的抑制劑已被證明對(duì)增加HR編輯成功是有效的（Yang等人，Int J Mol Sci）。在引入Cas9之前和之后，將這些抑制劑添加到培養(yǎng)基中會(huì)增加HDR，只需確保在一兩天內(nèi)去除抑制劑，以免影響細(xì)胞的生存能力。

富集S期細(xì)胞

HR主要作用于細(xì)胞周期的S期和G2期，此時(shí)姐妹染色單體可能作為修復(fù)模板存在。要最大限度地提高HDR釋放，請(qǐng)確保細(xì)胞在細(xì)胞周期階段中積極循環(huán)。如果細(xì)胞過(guò)度融合或培養(yǎng)基中沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們就不會(huì)進(jìn)行DNA復(fù)制，所以一定要注意這些細(xì)胞！更進(jìn)一步，你可以抑制負(fù)責(zé)S期過(guò)渡的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，使細(xì)胞在HDR促進(jìn)的周期中停留更長(zhǎng)時(shí)間。如果細(xì)胞停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，這種方法可能會(huì)對(duì)生存能力產(chǎn)生一些負(fù)面影響。長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞周期停滯可以在短短10小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

使用快速的Cas剪輯

如果晉升人力資源就像換掉你的Cas9一樣簡(jiǎn)單呢？可以！Cas12a是Cas家族成員，在切割時(shí)會(huì)產(chǎn)生粘性末端。Cas12a可能通過(guò)在斷裂部位產(chǎn)生ssDNA懸突來(lái)促進(jìn)HDR，這是早期的HR步驟（Moreno-Mateos等人，Nat-Com）。

另一種用于啟動(dòng)HR的Cas斷裂的方法是將HR蛋白融合到核酸酶上。與Cas9融合的早期HR因子已被證明可以通過(guò)在其他因子加載到斷裂上之前中斷進(jìn)行HR來(lái)增加HDR頻率，從而可能使修復(fù)沿著不同的途徑來(lái)進(jìn)行（Charpentier等人，Nat-Com）。

圖3:HDR切入與NHEJ介導(dǎo)的小插入和缺失型編輯競(jìng)爭(zhēng)。

References

Yu, Y., Guo, Y., Tian, Qigi, Lan, Y., et. al. An efficient gene knock-in strategy using 5’-modified dsDNA donors with short homology arms. Nat Chem Biol., 308(20): 1-9 (2020). 10.1038/s41589-019-0432-1

Mehdi Banan. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. J Biotechnol., 16(4): 387-390 (2020). 10.1016/j.jbiotec.2019.11.010

Wright, D. W., Shah, S. S., Heyer, W. D. Homologous recombination and the repair of DNA double strand breaks. J Biol Chem., 293(27): 10524-10535 (2018). 1 10.1074/jbc.TM118.000372

Yang, H., Ren, S., Yu, S., Pan, H., et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9 Induced-double strand breaks. Int J Mol Sci., 21(18): 6461 (2020). 10.3390/ijms21186461

Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLIFE. (2014) 10.7554/eLife.04766

Moreno-Mateos, M. A., Fernandez, J. P., Rouet, R., Vejnar, C. E., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and termperature-controlled genome editing. Nat. Com., 8(2024), (2017). 10.1038/s41467-017-01836-2

Charpentier, M., Khedher, A. H. Y., Menerot, S., Brion, A., et al. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair. Nat. Com., 9-1133 (2018). 10.3390/ijms21186461