1、機(jī)械刮除法

用不銹鋼絲末端的橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插入不銹鋼絲)或裹上少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓蒸氣滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。程序如下：

(1)標(biāo)記,顯微鏡下觀察，用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶(皿)的背面圈下需要的腫瘤細(xì)胞的部位。

(2)刮除棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶(皿)中，在肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記細(xì)胞空間。

(3)Hanks液沖洗1～2次，洗除被刮掉的細(xì)胞。

(4)加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至徹底刮凈為止。

2、反復(fù)貼壁法

根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類(lèi)細(xì)胞相互分離。方法如下(同貼壁傳代)：

(1)待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒去舊液，用0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液吹打分散，制成單細(xì)胞懸液。

(2)取三個(gè)培養(yǎng)瓶分別編號(hào)為A、B、C，首先把細(xì)胞懸液接種入A瓶，置溫箱中靜置培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后，慢慢吸出全部培養(yǎng)物，再接種于B瓶中，然后向A瓶中補(bǔ)充完全培養(yǎng)基置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)B瓶中的細(xì)胞靜置培養(yǎng)5～20分鐘后，按處理A瓶的方法，把B瓶中的培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液吸出并注入C瓶中，再向B瓶補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，C瓶補(bǔ)加少量小牛血清(濃度為10%)。

三個(gè)瓶一并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如操作成功，次日觀察，可見(jiàn)A瓶中主要為成纖維細(xì)胞，B瓶中兩類(lèi)細(xì)胞混雜，C瓶中主要為上皮細(xì)胞(癌細(xì)胞)，必要時(shí)可反復(fù)處理幾次直至癌細(xì)胞純化為止。

3、消化排除法

(1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后加入新的混合液繼續(xù)消化直到有半數(shù)細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，立即停止消化。

(2)把消化液離心棄去上清，沉下的細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸并吸入另一培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，向原瓶中補(bǔ)加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此法處理后，鑒于成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞先脫落，原瓶中留下的多為腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，就能把成纖維細(xì)胞除凈。

4、膠原酶消化法

本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。

(1)可用0.5mg/mL的膠原酶消化處理，邊消化邊在鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后即終止消化。

(2)用Hanks液洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞，若未清除凈，可再次重復(fù)。

5、密度梯度離心法

用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.025～1.085的密度梯度分離液，加入細(xì)胞懸液后，2500r/min離心10分鐘，在比重1.025～1.050層為成纖維細(xì)胞，在比重為1.065～1.085層為上皮細(xì)胞，將收集的上皮細(xì)胞經(jīng)洗液3次后，進(jìn)行培養(yǎng)可獲純凈的腫瘤細(xì)胞。在提取的時(shí)候加入適量的SOD也可抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。

啟達(dá)生物腫瘤細(xì)胞成球培養(yǎng)基是一款無(wú)血清，無(wú)動(dòng)物組分干擾的細(xì)胞株及原代腫瘤干細(xì)胞皆可成球的培養(yǎng)基；經(jīng)檢測(cè)和驗(yàn)證有以下4大特點(diǎn)：

      1. 大部分腫瘤細(xì)胞株可直接使用TSCM成球

      2.可培養(yǎng)復(fù)雜的球體和類(lèi)器官

      3.可維持同質(zhì)腫瘤球的傳代和擴(kuò)增

      4.無(wú)血清無(wú)動(dòng)物源蛋白組分，可保持實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一性和可驗(yàn)證性。