腫瘤微環(huán)境和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞尤其表現(xiàn)出其正常對應(yīng)物中不存在的腫瘤促進(jìn)能力（Calvo等人，2013；Hanahan和Coussens，2012）。因此，對腫瘤進(jìn)展過程中成纖維細(xì)胞中發(fā)生的修飾進(jìn)行功能和分子表征對于充分了解它們在腫瘤進(jìn)展中的作用至關(guān)重要。

一、乳腺或脂肪組織提取成纖維細(xì)胞方法：

1. 對于正常的乳腺組織，用眼科剪剪成1mm的碎片放入6CM培養(yǎng)皿中，再壓上20毫米的蓋玻片，以防止脂肪組織漂浮，然后慢慢添加準(zhǔn)備好的FGM成纖維培養(yǎng)基（啟達(dá)生物，貨號：P6001)，此培養(yǎng)基在提取細(xì)胞的時候需要把血清提高到10%, 培養(yǎng)基中含有小分子化合物抑制雜細(xì)胞生長，添加成纖維細(xì)胞生長所需蛋白，使用FGM成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基可提高細(xì)胞活性和純度。

使用此方法需要注意以下幾點(diǎn)：

1.培養(yǎng)基一定要緩慢添加，以避免玻片懸浮起來；

2.樣品需要與塑料和蓋玻片接觸，才能使成纖維細(xì)胞從樣品中出來;

3.7天后若觀察到大批成纖維細(xì)胞從組織中進(jìn)入蓋玻片和培養(yǎng)皿，可以轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

采用組織貼壁法提取的成纖維細(xì)胞

二、對于乳腺增生、腺瘤和癌組織樣本提取成纖維細(xì)胞的方法：

1.準(zhǔn)備好濃度為1mg/ml膠原酶溶液和含有10ug/ml的DNase 1完全培養(yǎng)基；

2.將分離的組織放入裝有適量膠原酶/分散酶的無菌管中。用移液管反復(fù)吹打幾次以幫助分解，然后將樣品在37°C和180 rpm的軌道振蕩器中孵育60分鐘，一般每個樣品使用2-3毫升（250-500毫克組織）。根據(jù)樣本大小進(jìn)行調(diào)整。

3.將一體積的含有1mM EDTA的PBS添加到每個樣品中，反復(fù)吹打數(shù)次；

4.使用3mm過濾器過濾樣品也可采用其他方法（橡膠注射器柱塞等）或者在室溫以100 x g離心5分鐘（此步驟主要去除未消化的組織塊。)

5.棄上清，用完全培養(yǎng)基洗滌過濾下來細(xì)胞的顆粒，并再次在RT下以100×g離心5分鐘。

6.將含有顆粒的細(xì)胞在RT下與完全培養(yǎng)基加DNase 1（最終濃度為10μg/ml）孵育10分鐘。

7.重復(fù)步驟5兩到三次。

8.離心后棄培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸在完全培養(yǎng)基中并接種在T25或T75瓶中(根據(jù)離心下來的細(xì)胞量進(jìn)行安排一般一個T25不能低于5*10^5cell），放入培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)。

9.30分鐘后，采用時差貼壁法對提取的細(xì)胞進(jìn)行第一次換液，（此時需要更換成含有2%FBS正常的FGM培養(yǎng)基）換液時用預(yù)熱的PBS輕輕洗滌一次，并將其放回培養(yǎng)箱中

10.在含有2%FBS的 FGM中培養(yǎng)3-5天后，大部分成纖維細(xì)胞可生長至80%以上，此時可按照正常方法凍存或者傳代即可。

酶消化提取的成纖維細(xì)胞

啟達(dá)FGM成纖維培養(yǎng)基(啟達(dá)生物，貨號：P6001）參考文獻(xiàn)：

1.Structural and biofunctional evaluation of decellularized jellyfish matrices，DOI;https://doi.org/10.1039/D3TB00428G

2.Collagen from Iris squid grafted with polyethylene glycol and collagen peptides promote the proliferation of fibroblast through PI3K/AKT and Ras/RAF/MAPK signaling pathways，https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.125772