內(nèi)皮細胞有較多生物學功能，可應用于動脈粥硬化的血管重塑，減輕血管損傷，預防心血管疾??；緩解糠尿病患者下肢缺血癥狀，防止非創(chuàng)傷截肢的發(fā)生；此外，內(nèi)皮細胞在以血管生成為靶向的藥物研究以及組織再生、創(chuàng)面愈合方面均有正面報道。

臍靜脈內(nèi)皮細胞的分離方法包括：機械刮取、組織塊移植、組織消化后磁珠分選法和膠原酶灌注法。前兩種方法細胞陽性率較低，第三種方法成本較高，目前均以第四種方法為主。

準備材料：新鮮的臍靜脈15-20cm，ECGM培養(yǎng)基，DMEM基礎，ＩＩ型膠原酶、０．２５％ 胰酶－ＥＤＴＡ、胎 牛 血 清、青 霉 素、鏈 霉 素 ，明 膠，兔抗人 ＶＩＩＩ因子抗體、ＦＩＴＣ標記山羊抗兔－ＩｇＧ。

操作方法如下：

1.無菌取新鮮臍帶 15 cm 左右, 投入無菌的PBS 液中。在超凈工作臺內(nèi), 取出臍帶, 用止血鉗夾 住臍帶兩端, 投入體積分數(shù)為 75% 的酒精中浸泡約 60 s，取出。

2.將臍帶放置于大平皿中，擠去血液，用巴氏吸管吸棄，剪去血腫多的和有夾痕的臍帶段。臍帶的一端剪斷，暴露出兩條臍動脈和一條臍靜脈（臍動脈壁厚，管腔小，靜脈壁薄，管腔大）。輸液延長管剪適當長度，插入臍靜脈3ｃｍ 以上，止血鉗固定。從延長管的一端用２０ｍＬ注射器吸取ＰＢＳ沖洗臍靜脈，吸棄洗液。

3.將臍帶轉移至新的平皿，結扎另一端臍帶，向臍帶注入體積為1mL/1cm膠原酶溶液（膠原酶溶液濃度為：1mg/ml，使用DMEM配制），充盈臍靜脈，止血鉗封閉端口，室溫下消化 15-20分鐘，并不時上下?lián)u動臍帶。

 4.消化完后，將下端結扎的止血鉗松開，消化液流入一個 50 ml 無菌離心管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次。

5.將收集到的懸液1000轉5分鐘離心獲得細胞懸液；

6.棄上清，使用額外提高血清到15%的ECGM內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液重懸細胞，接種于0.02%明膠預包被的T25培養(yǎng)瓶，于３７℃、５％ＣＯ２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

7.誘導貼壁24-48小時，全量換液，血清降為正常培養(yǎng)5%的濃度，去除未貼壁細胞，添加正常培養(yǎng)的新鮮ECGM內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，一套搞定細胞純化問題，隔天全量換液，待細胞融合度達80-90％時，用0.05-0.1％含EDTA胰酶消化傳代，得到人靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC。

8.采用ｖＷＦ抗體免疫熒光法鑒定 ＨＵＶＥＣ細胞，具體操作如下：從培養(yǎng)板中取出細胞爬片，ＰＢＳ洗３次，４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ； ０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００破膜；１０％山羊血清室溫封閉３０ ｍｉｎ；加入兔抗人ｖＷＦ抗體（１∶１００稀釋），放入濕盒內(nèi)，３７℃，６０ｍｉｎ；加入ＦＩＴＣ標記山羊抗兔－ＩｇＧ， ３７℃避光孵育６０ｍｉｎ；５μｇ·ｍＬ－１的 ＤＡＰＩ室溫襯 染細胞核２ｍｉｎ，熒光顯微鏡下觀察。

如下圖：

參考文獻研究發(fā)現(xiàn)孵育１０ｍｉｎ時，內(nèi)皮細胞并未完全脫落，細胞數(shù)量較少；孵育２０ｍｉｎ時，不僅內(nèi)皮細胞脫落，平滑肌細胞也部分脫落，給后期純化培養(yǎng)造成困難。最佳孵育時間是１５ｍｉｎ，此時，內(nèi)皮細胞消化完全，且沒有雜細胞的污染。

本文參考文獻：

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１６７１－８１５１（２０１５）０３－０２８５－０５

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