腫瘤干細(xì)胞是是一群既具有自我更新能力又具有較強(qiáng)的侵襲遷移的細(xì)胞，對腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用。腫瘤細(xì)胞的成球?qū)嶒?yàn)（成球大小及數(shù)目）是衡量腫瘤細(xì)胞干性的金標(biāo)準(zhǔn)。

腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)一般將分選干細(xì)胞放在無血清培養(yǎng)基、超低粘附培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，但也可以細(xì)胞系做。惡性程度高的細(xì)胞系是很容易成球的，但有的細(xì)胞系很困難，所以一般建議用腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞容易成球。

（1）一般選擇多大的培養(yǎng)皿，6孔板？

1、培養(yǎng)皿可以選擇6，12，24孔板，也可以選擇100 mm培養(yǎng)皿；

（2）接種密度？10000~100000個/ml還是說這個都要靠自己去摸索？有沒參考密度？

2、密度需要自己摸索。低密度常用于原代腫瘤干細(xì)胞的提取，篩選可以非粘附生長的細(xì)胞。高密度用于細(xì)胞球的擴(kuò)增，一般來說5000個/ml以上的細(xì)胞量成球比較好。
（3）怎么換液？

3、一周加兩次完全培養(yǎng)基。以6孔板為例，每次加入500ul，加入后輕輕搖勻，細(xì)胞球生長很緩慢，培養(yǎng)基中的生長因子至少能夠支持2周以上。直接加入腫瘤干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基，不推薦直接添加的細(xì)胞生長因子，確實(shí)會影響成球質(zhì)量。

一旦成球后需要消化傳代，細(xì)胞球傳代需要用弱的消化酶，可使用的是TrypLE Express。據(jù)說Accutase和Dispase也可以。消化步驟如下：

00001. 70μm的細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞球，胰酶消化。

00002. 2%BSA溶液終止消化，PBS清洗細(xì)胞2次。

00003. 重懸細(xì)胞，計數(shù)。

00004. 用超低吸附的細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞（6孔板中每孔加入大約1000個細(xì)胞）。

00005. 培養(yǎng)大約10-14天，觀察細(xì)胞成球情況并計算SPF。

成球能力是腫瘤干細(xì)胞體外鑒定的一個重要方法。其判斷的是單個細(xì)胞在合適的條件培養(yǎng)基中自我更新的能力，一般用細(xì)胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）表示。

SFE的計算方法：SFE=每孔中直徑大于75um的細(xì)胞球的個數(shù) / 每孔中原始接種細(xì)胞的總數(shù)

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