體內(nèi)的新血管由三個(gè)過(guò)程組成：血管生成、動(dòng)脈生成和血管形成。動(dòng)脈生成涉及重塑現(xiàn)有血管的成熟產(chǎn)生完全發(fā)育的功能性動(dòng)脈取決于內(nèi)皮細(xì)胞襯里和基底層的連續(xù)性，此外，與內(nèi)皮細(xì)胞的大小和形狀、交叉點(diǎn)，以及是否存在質(zhì)膜體的數(shù)量也有關(guān)系，內(nèi)皮細(xì)胞之間的功能異質(zhì)性參與控制血管收縮和擴(kuò)張，血液，凝血、纖溶、抗原存在、動(dòng)脈粥樣硬化和分解代謝脂蛋白。

But，血管是怎么生成的呢？掌握以下幾點(diǎn)，輕松搞定血管形成實(shí)驗(yàn)：

1. 準(zhǔn)備好P3-P5的HUVEC細(xì)胞，ECGM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，基質(zhì)膠，磷酸鹽緩沖鹽水，培養(yǎng)耗材

2. 從靶細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基

3. 為了制備條件培養(yǎng)基（CM），種子靶細(xì)胞并生長(zhǎng)至30-40％匯合（取決于細(xì)胞系的生長(zhǎng)速率），用無(wú)血清ECGM代替生長(zhǎng)培養(yǎng)基（例如 10ml 對(duì)于T75組織培養(yǎng)瓶;當(dāng)存在或不存在抗生素時(shí)無(wú)關(guān)緊要）24小時(shí)，然后當(dāng)細(xì)胞在T75組織培養(yǎng)瓶中達(dá)到60-80％匯合時(shí)收獲CM。

4. 使0.5ml等分的CM，并存儲(chǔ)在-80°C，如果它不是立即使用后收集CM。

                                                                                         HUVEC(啟達(dá)貨號(hào)：CD0290，P2）

5. 在進(jìn)行管形成測(cè)定之前，去除血清雙抗使HUVEC細(xì)胞饑餓3-6小時(shí)，若是使用T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加5ml左右的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。

6. 在用稀釋好的Matrigel包被96孔板后，用0.25%EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞脫落后，用雙倍含有血清的ECGM培養(yǎng)基中和，在室溫下通過(guò)在1,200rpm離心（276×g ）3-4分鐘，重懸于2-3ml無(wú)血清ECGM中，通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)胞測(cè)定HUVEC的濃度，并通過(guò)上下吹吸數(shù)次以4×10 ^5cells/ml用無(wú)血清的ECGM重懸HUVEC細(xì)胞次以確保均勻的單細(xì)胞懸浮 注意：對(duì)于稀釋的Matrigel，應(yīng)盡可能減少解凍/凍結(jié)循環(huán)。

7. 充分混勻，同時(shí)移取500微升的HUVEC細(xì)胞懸浮液到1.5毫升管。使用臺(tái)式離心機(jī)以4,000rpm（1,100rcf）旋轉(zhuǎn)細(xì)胞3分鐘。小心吸出上清液，不要觸及細(xì)胞沉淀。盡可能多地去除上清液。根據(jù)要使用的目標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量，在1.5毫升管中準(zhǔn)備適當(dāng)數(shù)量的HUVEC細(xì)胞。

解凍從程序A步驟2收集的靶細(xì)胞系的CM的0.5ml等分試樣，并用胎牛血清補(bǔ)充至終濃度為1％，以在程序B步驟5中重懸HUVEC細(xì)胞沉淀。

注意：每個(gè)靶細(xì)胞系應(yīng)該重復(fù)三次（每個(gè)孔需要100μl的HUVEC細(xì)胞懸浮液）。

用生長(zhǎng)因子減少的Matrigel涂覆96孔板

在使用前一天在4℃下融化適當(dāng)體積的生長(zhǎng)因子減少的Matrigel

預(yù)冷96孔板和移液器吸頭在-20°C 2-3小時(shí)

接近HUVEC細(xì)胞的血清饑餓結(jié)束并且在計(jì)數(shù)HUVEC細(xì)胞之前，在冰上將預(yù)冷的96孔板的每孔等分50μl生長(zhǎng)因子減少的Matrigel。旋轉(zhuǎn)板直到凝膠均勻分布在整個(gè)孔上。避免氣泡形成。使其在室溫下在水平表面上聚合1小時(shí)

將HUVEC細(xì)胞分配到涂覆的96孔板中

將100μl在程序B步驟6中獲得的HUVEC細(xì)胞懸浮液充分混合到96孔板的標(biāo)記孔中。將板在37℃，5％CO 2孵育4-6小時(shí)

使用光學(xué)顯微鏡可視化細(xì)胞。拍攝毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的圖像，并使用Scion Image軟件計(jì)算管長(zhǎng)度。